综述：食用菌菌糠多糖：其提取、纯化、结构特征及生物活性综述

本综述系统探讨了从食用菌废弃菌糠（SMS）中提取多糖（PS）的前沿进展，涵盖了提取纯化策略、结构解析技术及其多种生物活性（如抗氧化、免疫调节和抗肿瘤），为工业废弃物的高值化利用和功能性食品开发提供了重要理论依据与应用前景。

　　

引言

工业增长伴随大量废弃物产生，其处理是重大环境挑战，但同时也带来了资源化机遇。工业废物的价值化已被证明是减少其负面影响并将其转化为高附加值产品的有效策略。在此背景下，乳品加工业面临巨大挑战，其生产奶酪、酸奶等产品时产生大量乳清废液，历史上难以处理。然而，乳清富含蛋白质、乳糖和矿物质，可被回收用于生产能源、矿物质、副产品和膳食补充剂。

现有蛋白质提取技术及其局限性

多种先进技术已被提议用于从乳清中提取高附加值化合物。超滤（UF）和微滤（MF）允许分离和浓缩如β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）和α-乳白蛋白（α-lactalbumin）等蛋白质，这些在食品和制药工业中具有宝贵应用。然而，这些技术可能因膜维护而成本高昂，膜需要频繁清洁以避免堵塞，且使用寿命有限。此外，González-Amado等人使用水两相系统分离蛋白质和乳糖，但该方法需消耗过多水量。虽然纳滤和色谱法是纯化营养素和矿物质的有效技术，但它们需要高能耗和专用设备，增加了运营成本。其他研究使用水两相系统或磁性固相萃取（MSPE）实现了蛋白质提取，但产率低于60%或需要大量资源。

树枝状聚合物与纳米颗粒：创新的提取平台

一种替代的蛋白质提取方法基于与多价聚合物（如树枝状聚合物（dendrimers））的相互作用。树枝状聚合物是具有明确结构的大分子，其多价性源于其支化结构。这些特性为其在许多应用（如纳米医学或分析提取）中的使用提供了优异性能。例如，Giri课题组研究了聚酰胺胺（PAMAM）树枝状聚合物与人血清白蛋白（HSA）的相互作用，证明羧酸盐修饰的树枝状聚合物促进了相互作用。此外，碳硅烷（CBS）树枝状聚合物由于其外围羧酸盐和磺酸盐基团与蛋白质的相互作用，在蛋白质提取中也显示出有希望的结果。

然而，使用树枝状聚合物也存在局限性。通常，这些程序适用于提取/纯化水溶性蛋白质，这些蛋白质使用过滤或离心等方法从介质中去除具有挑战性且成本高昂。为了绕过这个缺点，已经进行了树枝状聚合物在材料表面的功能化，同时寻求两种系统之间的协同作用。例如，在过滤膜上接枝树枝状聚合物已被用于增强蛋白质分离。

纳米颗粒（NPs）是提取高价值产品的另一个有吸引力的选择。例如，功能化纳米材料在固相萃取中的应用已显示出巨大潜力，如用纳米棒功能化的膜。另一种方法是用活性基团涂覆NP表面以改善与生物大分子的相互作用，例如用均苯三酸修饰氧化铝颗粒以提取溶菌酶和血清白蛋白。NP也已被树枝状聚合物修饰，用于蛋白质提取或蛋白质检测领域。在这些材料中，磁性纳米颗粒（MNPs）由于其易于处理和广泛的应用范围而特别有前途。

树枝化磁性纳米颗粒的设计与合成

结合上述两种系统，即在MNPs上接枝树枝状化合物，寻找具有增强性能的新系统，已经被研究用于蛋白质提取。例如，MNPs被覆盖有小型羧酸盐CBS树枝状分子。这些树枝化的MNPs需要高的MNPs:蛋白质比率来回收所研究的蛋白质，尤其是对于像BSA这样的大蛋白质。通过施加外部磁场更容易分离，从而回收这类修饰的MNPs的可能性也使其非常有吸引力，正如在水污染物中所证明的那样。

与其它类型的聚合物相比，树枝状聚合物的一个优势是其明确的结构允许更好地建立结构与活性之间的关系。此外，活性基团主要位于树枝状聚合物表面，有利于与目标的相互作用。例如，我们观察到阳离子CBS树枝状聚合物作为抗菌剂比类似的超支化聚合物更具活性。因此，预计这些因素将对NPs性质产生重要影响。实际上，与线性系统相比，接枝聚乙二醇树枝状分子的MNPs显著提高了胶体稳定性。在不同的工作中，用胺功能化聚合物和树枝状聚合物修饰的二氧化硅清楚地表明，二氧化硅-树枝状聚合物的Zeta电位更正，因此，这些材料增强了蛋白质吸附。此外，覆盖有胺和铵树枝状分子及树枝状聚合物的二氧化硅明显比覆盖有线型烷基链的二氧化硅更稳定，因为这些线型链容易向后折叠覆盖二氧化硅表面，减少了活性官能团的存在。

磁性纳米颗粒的功能化与表征

本研究旨在评估涂覆有CBS树枝状聚合物的MNPs作为从奶酪生产副产品乳清中回收蛋白质的可持续替代方案的性能。为此，我们选择了树枝状聚合物而不是树枝状分子，以增加树枝状衍生物表面的官能团数量，旨在促进MNPs与蛋白质的相互作用，因为获得更大的树枝状聚合物在合成上比树枝状分子更简单、更快。我们合成了接枝有含不同官能团（胺(-NH₂)、羟基(-OH)、羧酸盐(-CO₂^?)和硫酸盐(-OSO₃^?)）的树枝状聚合物的MNPs，以测试它们提取模型蛋白质的效率。这些蛋白质将在分子量和等电点方面有所不同（溶菌酶(LYS)、肌红蛋白(MYO)、伴刀豆球蛋白(CONC)和牛血清白蛋白(BSA)）。在选择最有效的MNPs用于蛋白质结合和释放后，将进一步研究其从乳清中选择性回收蛋白质的可行性，特别是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

采用将含有至少一个伯胺官能团的树枝状聚合物连接到覆盖有异硫氰酸酯连接单元的MNPs的策略来实现MNP的功能化。这些连接单元是通过首先用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)处理裸MNP（MNP-0），随后与对苯二异硫氰酸酯(PDITC)反应引入的。接下来，这些MNP-PDITC通过一个分支的胺基与所需的树枝状聚合物反应。通过该程序，我们获得了分别用含有胺基（MNP-NH₂）或羟基（MNP-OH）的CBS树枝状聚合物修饰的MNPs。通过向MNP-OH添加SO₃·py加合物（py，吡啶）并进行进一步的碱处理，将硫酸盐官能团引入MNPs，得到相应的硫酸盐MNPs MNP-OSO₃^?。所有MNPs均从裸MNP-0制备，通过TEM观察到的新MNPs尺寸相似。通过热重分析（TGA）获得了关于MNPs表面功能化的信息，该技术突显了MNP-NH₂中每个MNP的树枝状聚合物密度更高。Zeta电位显示的值取决于树枝状聚合物的官能团，羧酸盐和硫酸盐MNP为负值，胺和羟基MNP为正值。MNP-OH和MNP-OSO₃^?的值最接近零，但从MNP-OH的正值变为MNP-OSO₃^?的负值证实了从MNP-OH到MNP-OSO₃^?的转变。通过与裸MNP-0的IR光谱比较，也通过IR光谱证明了树枝状聚合物在MNP表面的引入。

捕获研究与机理探讨

使用四种模型蛋白质来探索MNPs的捕获能力。这些蛋白质显示出不同的分子量和等电点。研究比较了所有MNPs在不同条件下对每种蛋白质的捕获。为此，将MNPs分散体添加到已知浓度的蛋白质溶液中。处理后，通过磁分离去除MNPs。溶液中蛋白质的初始和最终浓度之间的差异给出了MNPs的捕获能力。

结果显示，只有少数MNP、蛋白质和pH的组合导致捕获率接近100%。在pH 7时观察到最佳的全局结果。尽管在某些情况下，100:1的比率捕获率更高（突出显示在pH 7和9时的MNP-NH₂），正如所预期的那样，但在其他情况下并未观察到这一点。这可能是由于MNP聚集，可以从该浓度下系统的快速沉淀推断出来。然而，10:1的捕获对于某些MNP/蛋白质组合也非常有效，也主要是在pH 7和9时。

另一方面，在酸性pH下，MNP的捕获能力相当低，MNP-CO₂^?和MNP-OSO₃^?在该pH下最有效。此外，在这种低pH下，MNPs的稳定性明显降低，对于裸MNP-0更为明显，由于其高分解程度而无效，因为MNP核心缺乏树枝状聚合物的保护屏蔽。

低树枝状聚合物:蛋白质比率使得能够区分MNP-OH受pH变化的影响最小，尽管这些MNP通常也与阴离子MNP-OSO₃^?一起效果最差。这些事实可能归因于这些类型MNPs（羟基和硫酸盐）的活性部分质子化/去质子化的能力明显较低，这限制了MNPs和蛋白质之间可能的静电吸引，与覆盖有胺和羧酸盐官能团的MNPs形成对比。

数据显示，这些MNPs的捕获能力受静电相互作用支配。在MNPs的电荷与蛋白质的电荷明显相反的条件下，实现了最高捕获。在这个意义上，MYO、CONC和BSA在pH 7和9时带负电荷，而LYS显示正电荷。在此pH下，带正电荷的MNPs，MNP-NH₂，对MYO、CONC和BSA显示出最佳结果，而带负电荷的MNPs，MNP-OSO₃^?和MNP-CO₂^?，对LYS（pI = 11.4）显示出最佳结果。这些结果改善了先前用羧酸盐CBS树枝状分子装饰的树枝化MNPs的行为，后者仅在pH 9.1和比率100:1时实现了Lys的100%蛋白质提取，以及在pH 7.5和比率500:1时实现了BSA的提取。

回收研究与可重用性验证

任何提取系统的一个显著目标是其可重用性。我们已经在pH 7和摩尔比100:1下捕获蛋白质后，用最活跃的MNPs MNP-NH₂探索了这种可能性。选择用于在捕获蛋白质后破坏MNP:蛋白质相互作用的试剂是SDS，因为它先前已成功使用。为了评估温度在破坏相互作用中的影响，用0.4% SDS溶液处理MNPs 10分钟，在100°C孵育和不孵育。通过测量在连续循环中SDS处理后的蛋白质捕获能力来评估MNPs回收，包括蛋白质捕获后的回收步骤和额外的洗涤步骤。在pH 7时带正电荷的溶菌酶（LYS）被排除，因为带正电荷的MNP-NH?显示出较差的捕获效率。

结果显示，在所有蛋白质的每种回收条件下，捕获在6个循环期间得以维持，对于最大的蛋白质BSA，每个循环后略有下降。当包括在100°C的预孵育步骤时，循环之间没有观察到差异。因此，在环境温度下的该程序是优化回收处理的有希望的选择。此外，与我们先前用羧酸盐树枝状分子覆盖MNPs的研究相比，加入树枝状聚合物而不是树枝状分子改善了回收，因为用树枝状分子我们需要加热到100°C进行蛋白质回收。捕获/释放循环中另一个可能有问题的问题是MNPs的损失。在优化测定条件后；超声时间、温度、分离时间，我们没有观察到MNPs的损失。通过ICP对上清液进行验证，获得的铁值低于定量限。

为了确认释放处理后蛋白质的分离，进行了聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析。显示从循环I到IV释放的蛋白质的相应信号。在所有泳道中检测到蛋白质，表明蛋白质和MNPs之间的相互作用被成功破坏，允许回收蛋白质。

从奶酪乳清中提取蛋白质的实际应用

考虑到先前讨论的结果，选择用含胺基团的CBS树枝状聚合物修饰的MNPs，MNP-NH₂，在pH等于7时，评估其从奶酪乳清中提取蛋白质的可行性。为此，使用了含有山羊和牛奶混合物的液体奶酪乳清（从工业中获得）。通过RP-HPLC对该乳清的分析显示四个峰。基于与牛奶α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准的比较，可以对这些峰进行归属。因此，4.87分钟的峰可能对应于山羊α-乳白蛋白，8.79分钟的峰来自山羊β-乳球蛋白，而5.89分钟和9.54分钟的峰对应于它们在牛奶中的同源物。其他峰是杂质，或乳清中存在的其他次要蛋白质。接下来进行了进一步研究，以评估整体提取乳清蛋白质的最佳MNP:乳清比率。使用了从1:1到750:1（w/w）的MNP:乳清比率，观察到在MNP:乳清比率高于500:1时乳清蛋白质完全回收。

糖类干扰研究

奶酪乳清具有复杂的组成，存在的其他化合物可能会干扰蛋白质捕获。例如，糖类以高浓度存在，主要是乳糖。为了研究这种干扰，通过NP-HPLC分析了原始乳清，并将色谱图与使用MNP:乳清比率100:1和500:1（w/w）捕获蛋白质后观察到的色谱图进行了比较。原始乳清显示两个主峰（在7.60和11.86分钟），对应于糖类，其中11.86分钟的峰对应于乳糖。蛋白质捕获后这些峰的大小保持不变，这表明MNP-蛋白质相互作用是选择性的，并且奶酪乳清中的糖类不干扰蛋白质捕获。

乳清蛋白质提取循环

一旦为仅一次捕获/释放实验确定了比率，并且乳清中的糖类不干扰蛋白质捕获，就重复捕获/释放过程以确定回收MNPs的可能性。描绘了十次连续测试的蛋白质捕获和MNPs回收。在所有循环中蛋白质捕获达到100%。可以在温和条件下回收MNPs，仅使用SDS在环境温度下。显示了每个循环上清液的色谱图，其中未观察到归属于蛋白质的峰。这证明用MNP-NH₂能够提取奶酪乳清中包含的所有蛋白质。

结论

用含有不同官能团（胺(-NH₂)、羟基(-OH)、羧酸盐(-CO₂^?)和硫酸盐(-OSO₃^?)）的CBS树枝状聚合物修饰的MNPs进行蛋白质提取和回收的研究指出，该过程受pH、蛋白质电荷和树枝状聚合物官能团的控制。因此，对于在这些pH下带负电荷的蛋白质（如MYO、CONC和BSA），而树枝状聚合物带正电荷，在中性和碱性pH下用MNP-NH₂获得了最佳捕获结果。然而，相反的情况，酸性pH和阴离子树枝状聚合物修饰的MNPs，则不太有利。在使用0.2% SDS溶液在室温下优化条件破坏MNP-蛋白质相互作用后，MNPs被成功重复使用。

MNP-NH₂在从乳品工业副产品（如奶酪乳清）中分离蛋白质方面也有效。此外，该提取过程对样品中的糖类具有选择性，因为MNP-NH₂去除了蛋白质（主要是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白），但没有去除糖类（主要是乳糖）。这些MNP-NH₂最多可重复使用10次捕获-释放循环，证明了其作为更污染、效率较低且更昂贵的用于回收乳清蛋白质程序的可持续替代品的潜力。

因此，这项研究表明，选择性和可重复使用的磁性纳米颗粒（MNPs）可以通过实现从废物流中靶向回收蛋白质来克服工业膜过滤的关键限制，例如污垢和低选择性。通过调整MNPs上的官能团以适应特定蛋白质，我们提供了一种高效的替代方案，结合了高选择性与简化的分离和提高的回收率。然而，该技术的实施需要克服一些缺点，例如在修饰MNPs的合成中使用的过量树枝状聚合物或与蛋白质相比相对较大的NPs过量。同样，使用其他具有简单合成方法的多功能系统，如超支化聚合物或假树枝状聚合物，对于这个目标可能非常有吸引力，尽管树枝状聚合物为建立结构-活性关系提供了更好的框架。