牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌三重qPCR方法的建立与流行病学调查

　　 摘要:

目的 建立牛支原体(Mycoplasma bovis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, P.m)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica, M.h)的三重qPCR检测方法，并开展规模化奶牛养殖场牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex, BRDC)的流行病学调查。 方法 以实验室分离鉴定后纯化的菌株制备敏感性质控样品；选取国内主要流行株的保守基因，分别以牛支原体的uvrC基因、多杀性巴氏杆菌的Kmt1基因和溶血性曼氏杆菌的lktD基因作为靶标，建立多重探针和引物体系，优化反应体系参数，构建三重qPCR方法。验证该方法的敏感性、重复性和特异性，并与细菌分离鉴定方法进行符合率验证。利用该方法对1 252份临床疑似BRDC的样本进行病原学检测，分析病原的流行特征和时空分布特征。 结果 三重qPCR方法的标准曲线R ²值分别为0.998 6、0.994 6和0.998 6；牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的最低检出量分别为2.50×10³、1.26×10³和7.50×10² CFU/mL。批内和批间变异系数均小于2%，仅3种菌的敏感性质控样品出现特异性扩增曲线。符合率试验结果显示，牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌与细菌分离鉴定方法的符合率分别为100.00%、98.40%和97.60%。流行病学调查显示，BRDC细菌性病原总阳性率为75.9% [95% confidence interval (CI), 73.4%-78.3%]，其中混合感染占比48.8%，冬季为高发期，北方地区阳性率显著高于南方(P<0.001)。 结论 本研究建立的三重qPCR方法具有良好的特异性、稳定性和重复性，为我国BRDC主要病原的一步法检测提供了候选方案。本研究还分析了BRDC细菌病原的协同感染特征及地理-季节分布规律，为精准防控策略的制定提供了参考。