FCRL5作为B细胞标志物在多发性硬化症中的创新诊断与预后价值

本研究揭示FCRL5（Fc受体样蛋白5）作为多发性硬化症（MS）的新型脑脊液（CSF）生物标志物，其表达水平可区分MS与其他神经系统炎性疾病（OIND），并预测MRI新病灶风险。研究发现MS患者外周血CD19+CD11c+FCRL5+ B细胞具有独特转录特征，且FCRL5表达受布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi）调控，为MS的免疫病理机制和靶向治疗提供新见解。

　　

Abstract

Background and Objectives

Fc受体样蛋白5（FCRL5）是一种IgG结合受体，已知在双阴性（DN）和非典型记忆B细胞（atMBC）中高表达，这两类细胞在炎症状态下常扩增。然而，其在多发性硬化症（MS）中的表达特征尚不明确。本研究旨在分析MS患者脑脊液（CSF）、血清和外周血单个核细胞（PBMC）中FCRL5的表达，并明确MS中FCRL5⁺ B细胞的表型和转录特征。

Methods

采用基于邻近延伸分析（PEA）的蛋白质组学技术，对复发缓解型MS（RRMS，n=59）和对照组（n=29）的CSF进行分析。通过单分子阵列（SIMOA）技术在包含RRMS（n=40）、对照组（n=30）和其他炎症性神经系统疾病（OIND，n=20）的队列中验证FCRL5上调现象。同时，在58例接受3T MRI的MS患者中评估血清FCRL5水平。此外，通过流式细胞术和RNA测序分析RRMS患者和对照组PBMC中FCRL5⁺ B细胞的表型和转录特征，并在体外评估布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi）对FCRL5的调控作用。

Results

与对照组和OIND相比，RRMS患者CSF中FCRL5显著上调。CSF FCRL5水平升高与24个月内新发脑病灶风险增加相关。血清FCRL5水平与CSF测量值无相关性，但与皮质和近皮质病灶负荷呈负相关。流式细胞分析显示，RRMS患者外周CD19⁺FCRL5⁺ B细胞通过强CD11c表达与对照组区分。CD19⁺CD11c⁺FCRL5⁺细胞的转录谱在两组间显著差异，表现为体液反应基因表达降低和炎症信号增强。此外，FCRL5调控被发现是BTK依赖性的。

Discussion

可溶性FCRL5可作为MS诊断和疾病活动预测的有前景生物标志物。研究还强调MS中CD19⁺CD11c⁺FCRL5⁺ B细胞具有独特的转录特征。

Introduction

MS是一种慢性免疫介导的中枢神经系统炎症性疾病，以脱髓鞘和神经退行性变为特征。早期阶段以外周免疫细胞侵入CNS导致多灶性炎症为特点，常引发临床和/或放射学复发。后期进展阶段主要涉及CNS内慢性炎症过程，包括弥漫性小胶质细胞激活和异位脑膜淋巴滤泡形成。

传统认为MS是T细胞介导的疾病，但B细胞耗竭疗法在RRMS和原发进展型MS中的疗效突显了B细胞在炎症和神经退行性过程中的关键作用。目前关注焦点在于IgD^?CD27^?双阴性（DN）和CD21^-/low CD11c⁺非典型记忆B细胞（atMBC），这些细胞在健康个体中存在，但在慢性抗原刺激下频率增加。

这些细胞亚群在多种自身免疫病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎）和慢性感染（如疟疾、HIV）中增多并与病理特征相关。2016年报道称DN B细胞和类似atMBC的"年龄相关B细胞"在部分MS患者中扩增，可能参与炎症过程。然而，这些细胞在MS中的作用仍研究不足。

这些表型异质的细胞亚群通常以重叠表达标志物为特征，如Tbet、CD11c、CXCR5、FCRL4和FCRL5。FCRL5常与DN2和atMBC相关，能结合IgG，但其功能作用因细胞内域同时存在酪氨酸基免疫受体激活和抑制基序（ITAM/ITIM）而模糊不清。研究表明其可能激活或抑制B细胞。可溶性FCRL5在淋巴增生性疾病患者血清中升高，但尚未在自身免疫或炎症性疾病中评估。

在MS背景下，除血清神经丝轻链（NfL）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等有前景的标志物外，识别能深入反映免疫病理过程的生物标志物备受关注。尽管CSF特异性IgG寡克隆带（OCB）和CSF kappa游离轻链是诊断生物标志物，但其存在不能反映产生B细胞的表型或激活状态。反映免疫活性的生物标志物有助于推动个体化医疗和改善治疗反应评估。

本研究通过PEA蛋白质组学分析，发现RRMS患者CSF中7种失调蛋白，其中FCRL5在MS患者中独立于炎症疾病活动性上调。因此，研究深入探讨FCRL5作为易测量CSF标志物的作用，强调其区分MS与对照组和OIND的潜力及其与MRI新病灶的关联。同时研究MS患者和对照组FCRL5⁺外周B细胞的表型和转录组差异，以及BTKi对FCRL5表达的影响。结果表明FCRL5⁺ B细胞通过独特免疫学特征在MS病理生理中起重要作用，可溶性FCRL5作为有前景的诊断和预后生物标志物。

Methods

Patients and Cohorts

2018年1月至2022年1月期间，在布鲁塞尔圣卢克大学医院收集症状对照组（SC）、MS患者和CNS其他炎症性疾病（OIND）患者的CSF、血清和PBMC。样本按国际指南处理后于?80°C储存。SC定义为神经学检查正常、生物学和MRI结果无异常。MS诊断遵循2017年McDonald标准。复发定义为临床活动和/或MRI出现钆增强病灶（GEL）。纳入四个患者队列："发现队列"用于蛋白质组学分析，包括29例SC和59例未接受疾病修饰治疗（DMT）的RRMS（29例缓解期，30例复发期），无并发感染；"验证队列"包括30例SC、40例未接受DMT的RRMS和20例OIND患者；"MRI队列"包括58例接受广泛3T脑MRI的MS患者；7例RRMS和5例25-35岁健康对照的PBMC用于FACS分析和RNA测序。

Standard Protocol Approvals, Registrations, and Patient Consents

患者签署内部监管文件，声明诊断剩余样本可用于回顾性学术研究，无需额外知情同意（伦理委员会批准号2007/10SEP/233和2020/14AVR/221）。

Proteomic Analysis

使用Olink Explore平台（瑞典乌普萨拉）通过PEA结合下一代测序评估362种CSF蛋白的相对表达。数据以NPX（标准化蛋白表达）值表示，这是Olink在log2尺度上的相对蛋白定量单位。7种蛋白未通过标准或Olink批次释放QC被排除。所有样本通过QC。70%的蛋白在≥50%样本中高于检测限（LOD）被保留分析。差异表达分析使用Olink Analyze R包进行，采用Welch t检验（95%置信水平）并通过Benjamini-Hochberg方法校正多重检验。

FCRL5 Assays

验证队列CSF中FCRL5浓度使用定制SIMOA在HD-X分析仪（Quanterix, MA）上测量。样本重复检测，二倍稀释，并通过七点校准曲线定量。检测下限（LLOD）为0.0095 ng/mL。血清FCRL5水平使用RayBiotech人FCRL5 ELISA试剂盒（RayBiotech, GA）测量，REC-1细胞上清使用PicoKine ELISA试剂盒（Booster Biological Technology, CA）测量，遵循各自制造商协议。上清收集后离心两次（10分钟, 1500g）去除残留细胞，分析前于?80°C储存。

Biological Parameters

CSF白细胞计数（WBC）使用Sysmex XN-1000体液分析仪（日本神户）测定。血清和CSF IgG、IgA、IgM水平使用Immage 800（Beckman Coulter）测量。免疫球蛋白指数计算公式：IgG指数 = (CSF IgG/血清IgG)/(CSF白蛋白/血清白蛋白)，IgA和IgM指数类似。OCB检测通过等电聚焦琼脂糖凝胶电泳使用Hydrasys 2系统（Sebia, Norcross, GA）进行。

Cell Culture

PBMC通过Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）密度梯度离心制备，并按先前描述储存于液氮。REC-1细胞（ATCC-CRL-3004）培养于RPMI 1640-Glutamax（Life Technologies, Inc.）补充10%胎牛血清（FBS, Life Technologies, Inc.）和1%青霉素-链霉素（15140-122, Gibco），在37.5°C、5%二氧化碳下孵育。细胞悬液以3.5 × 10⁵细胞/mL浓度接种于12孔板，并用evobrutinib（M2951, Targetmol Chemical Inc.）以所需浓度稀释于培养基处理。处理24小时用于RT-qPCR和ELISA（上清），48小时用于流式细胞术。对照孔接受相当于300 nM evobrutinib浓度的DMSO。

Flow Cytometry Analysis

PBMC在37°C解冻，依次用含10% FBS（Gibco）的RPMI1640培养基（Gibco）和FACS缓冲液（PBS补充1 mM EDTA和1% FBS）洗涤，然后用Fc受体阻断溶液（Human TruStain FcX; BioLegend）处理，再用抗FCRL5-APC、CD19-FITC和CD11c-PE单克隆抗体（克隆号509f6、HIB19和Bu15; BioLegend）染色。REC-1细胞用杜氏PBS（DPBS）洗涤，离心（5分钟, 300g）重悬于4 × 10⁵细胞/mL，室温避光用抗FCRL5-APC（克隆509f6, BioLegend）染色15分钟。数据在BD FACS Canto II分析仪（Becton Dickinson）上获取，用FlowJo软件分析。门控策略见eFigure 1。

RNA Extraction and RT-qPCR

用evobrutinib（300 nM）或DMSO（对照）孵育24小时后，收集细胞，用DPBS洗涤，按先前描述进行RNA提取、反转录和40循环PCR。基因表达使用2^?ΔΔCt方法以RPL19为参照基因归一化。引物序列见eTable 3。

RNA Sequencing and Bioinformatic Analysis

6例RRMS和5例对照PBMC样本解冻、洗涤和染色如流式细胞术部分所述。CD19⁺CD11c⁺FCRL5⁺细胞使用BD FACSAria III（BD）分选到RLT裂解缓冲液（Qiagen）中，RNA提取（RNeasy Micro Kit, Qiagen）前于?80°C储存。RNA-seq文库制备并在Illumina平台（Novogene, Munich）测序。mRNA使用poly-T寡核苷酸磁珠富集。3个样本（1对照, 2 RRMS）文库制备失败被排除。剩余文库通过QC并测序。读段使用HISAT2（v2.2.1）比对到GRCh38，基因计数使用featureCounts（v2.0.6）获得。差异表达使用edgeR（v4.0.16）分析。1例对照样本因主成分分析中强离群谱被排除下游分析。同时分析公开数据集（GEO: GSE173789）中MS（n=23）和对照（n=14）分选CD19⁺ B细胞。

MRI

MRI队列参与者在3T GE SIGNA Premier研究MRI扫描仪（General Electric, Milwaukee, WI）配备48通道头线圈上进行脑成像。MRI协议包括：（1）矢状位3D液体衰减反转恢复（FLAIR）序列（TR=5000 ms, TE=105 ms, TI=1532 ms, FOV=256 mm, 层数=170, 体素大小=1.0×1.0×1.0 mm）；（2）矢状位3D磁化准备2快速梯度回波（MP2RAGE）序列（TR=1925 ms, TE=3 ms, TI=700和2500 ms, FOV=256 mm, 层数=156, 体素大小=1.0×1.0×1.0 mm）；（3）矢状位双反转恢复（DIR）序列（TR=7000 ms, TE=90 ms, TI=2878 ms, FOV=256 mm, 层数=160, 体素大小=1.0×1.0×1.3 mm）。

皮质病灶由两名评估员（P.M.和A.S.）在DIR和MP2RAGE图像上独立评估，遵循最新共识指南。初始分歧时，两名评估员另行会议达成共识。皮质病灶在FLAIR图像上手动分割。

Statistical Analysis

统计分析和图表使用GraphPad Prism 8.0.2生成。数据集分布正态性通过D'Agostino和Pearson检验验证。除非另有说明，执行Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis单因素ANOVA与Dunn事后多重比较检验。ELISA和SIMOA测量值低于检测限时，用一半LLOD替代。相关分析计算Spearman相关系数。受试者工作特征（ROC）分析使用MedCalc软件（比利时奥斯坦德）进行。

Results

CSF PEA Analysis Identifies Differentially Expressed Proteins Between Controls and Patients With RRMS

CSF的PEA分析鉴定出RRMS与SC间7种显著失调蛋白：6种上调（FCRL5、NEFL、CXCL13、CRTAM、MMP9和TNFSF14），1种下调（CCL2）。FCRL5变化倍数最高（3.18, p=1.84×10^?11）。无差异表达蛋白能显著区分复发MS与缓解MS。

FCRL5 Is Upregulated in the CSF of Patients With RRMS Compared With Controls and Other Inflammatory Diseases of the CNS

SIMOA分析证实PEA发现，显示RRMS患者CSF FCRL5水平显著高于OIND和SC组（均值：0.774 ng/mL vs 0.140 ng/mL和0.030 ng/mL；p=0.0038和p<0.0001）。总体而言，高于LLOD的值在3.3%对照（1/30）、20% OIND（4/20）和62.5% RRMS患者（25/40）中获得，显示统计学显著差异（χ平方=9.64；p值<0.005）。在RRMS和OIND组中评估了FCRL5表达与临床和生物学的相关性。RRMS患者中，FCRL5与WBC计数、CSF IgG水平和IgG指数显著相关。未发现与IgM和IgA指数的显著相关。相反，OIND组中FCRL5值与IgG浓度无显著相关。此外，RRMS组中，39例OCB阳性患者中25例（64.1%）观察到FCRL5表达高于LLOD，唯一OCB阴性患者未检测到。OIND组中，8例OCB阳性患者中2例（25%）和12例OCB阴性患者中2例（16.7%）检测到FCRL5表达。Fisher精确检验未揭示任一组中OCB状态与FCRL5表达的显著关联。

CSF FCRL5 Levels in RRMS Predict the Occurrence of New MRI Brain Lesions Within 24 Months

在发现队列中，基线CSF FCRL5水平较高的患者随访至2年更可能发生脑MRI新病灶（n=37, p=0.002）。该关联在验证队列中得到进一步证实，有新发脑和/或脊髓T2/FLAIR MRI病灶患者平均CSF FCRL5值为1.516 ng/mL（95% CI: 0.535–2.498），而无新MRI病灶患者为0.182 ng/mL（95% CI: ?0.018–0.382）（n=31, p值: 0.0039）。验证队列ROC分析显示预测新MRI病灶的曲线下面积（AUC）为0.79（p<0.0005; 95% CI 0.606–0.914）。Jouden J统计显示最佳截断值为0.532，j指数0.496，敏感性和特异性分别为56.25%和93.33%。使用该截断值，将患者分为高FCRL5（>0.532 ng/mL）和低FCRL5组，评估24个月随访时无新MRI病灶患者比例。24个月随访时，高和低CSF FCRL5组中分别有10%（1/10）和64%（14/22）患者无新MRI病灶。尽管有此发现，CSF FCRL5浓度与基线GEL存在无显著相关，且不能预测后续复发或EDSS恶化。值得注意的是，其他常规参数如IgG指数对新MRI病灶的预测价值不显著，AUC为0.68（p=0.122）。

Serum FCRL5 Concentration Does Not Discriminate RRMS From Controls, but Its Level Is Inversely Correlated With the Burden of Cortical and Juxtacortical Lesions

由于蛋白质组学分析仅在CSF进行，我们调查了FCRL5浓度是否能在验证队列中区分未接受DMT的RRMS患者与对照。ELISA测量的FCRL5蛋白水平两组间无显著差异。此外，我们检查了比较MS患者和对照CD19⁺ B细胞的公开RNA-seq数据（GEO: GSE173789）。数据集分析显示这些组间FCRL5表达无显著变化。

我们进一步分析MRI队列中血清FCRL5水平与采样时脑MRI特征的关系。发现血清FCRL5水平与皮质病灶数量和体积（Spearman R: ?0.39和?0.38, p值: 0.001和0.002）及近皮质病灶数量（Spearman R: ?0.42, p值: <0.001）呈显著负相关。皮质病灶负荷较高（>500 mm³）和≥10个近皮质病灶的患者血清FCRL5水平显著较低（p=0.0106和0.0146）。使用这些阈值，ROC曲线分析显示对皮质和近皮质病灶负荷的AUC分别为0.73（p=0.002, 95% CI 0.573–0.821；敏感性=100%, 特异性=42.22%）和0.71（p=0.0034, 95% CI 0.573–0.821；敏感性=80%, 特异性=59.52%）。

Peripheral Blood CD19⁺FCRL5⁺ B Cells From RRMS Strongly Express CD11c Compared With Controls

对RRMS患者（n=7）和健康对照（n=5）的PBMC进行流式细胞分析，评估CD19⁺FCRL5⁺ B细胞的CD11c表达。如在血清水平先前观察到的可溶性FCRL5表达无差异，我们发现两组间CD19⁺ B细胞上FCRL5⁺比例和FCRL5平均荧光强度（MFI）无显著差异。类似地，总CD19⁺ B细胞群体上CD11c表达的比例和MFI组间无差异。

然而，RRMS患者的CD19⁺FCRL5⁺ B细胞与对照相比表现出显著不同表型，几乎所有RRMS CD19⁺FCRL5⁺细胞表达CD11c（均值: 86.44%; 95% CI 80.02–92.87），而对照表达较低（均值: 49.00%; 95% CI 22.15–75.85），且RRMS组CD11c MFI显著更高。相反，MS患者和对照间CD19⁺CD11c⁺ B细胞中FCRL5⁺细胞的比例和MFI无显著差异。值得注意的是，在CD19⁺细胞中，尽管CD11c⁺FCRL5⁺细胞比例组间无显著差异，但RRMS中CD11c^?FCRL5⁺细胞比例较对照显著减少。

RNA Sequencing Analysis of Peripheral Blood CD19⁺CD11c⁺FCRL5⁺ B Cells Highlights Transcriptomic Differences Between RRMS and Controls

由于CD19⁺CD11c⁺FCRL5⁺ B细胞在对照中也被检测到，对分选细胞进行批量RNA测序，以识别RRMS（n=4）和对照（n=3）间差异表达基因，并研究其在MS中的转录谱和功能状态。我们首先检查了文献中通常用于定义B细胞亚群的关键标志物表达（MS4A1 (CD20)、CD19、CR2 (CD21)、CD27、CD24、ITGAX (CD11c)、TBX21 (Tbet)、CD38、FCRL4和FCRL5），以确认细胞的记忆B细胞特征以及CD11c和FCRL5的高表达。

差异表达基因分析鉴定出48个MS患者与对照间差异表达基因（24个上调，24个下调）。RRMS中上调的基因包括TNF和HLA-DRB5，增强了炎症信号。相反，免疫球蛋白可变区基因（IGHV1-69、IGHV2-70、IGHV3-21、IGHV3-11和IGKV2-24）、浆细胞标志物CD38和趋化因子受体CX3CR1的下调表明B细胞功能受损和体液活性降低。

FCRL5 Expression Is Regulated by a Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Pathway

先前转录组学研究显示，各种BTK抑制剂体内治疗下调FCRL5表达。为在转录和蛋白水平（包括对其可溶性形式的影响）证实这些发现，用evobrutinib（一种选择性、不可逆第二代BTKi）处理REC-1细胞（一种具有高FCRL5表达的套细胞淋巴瘤系）。通过qPCR和流式细胞术测量FCRL5 mRNA和蛋白水平，ELISA测量上清中可溶性FCRL5。如图所示，处理后FCRL5 mRNA减少。表面表达剂量依赖性下降，可溶性水平也降低。

Discussion

本研究通过PEA蛋白质组学分析鉴定出MS患者CSF中FCRL5过表达。我们在验证患者队列中使用SIMOA作为独立测量方法验证了这一结果。此外，我们首次证明FCRL5作为CSF标志物在区分MS与OIND方面的优越性，其中FCRL5水平高于LLOD仅见于4例OIND（2例神经结节病，1例炎症性垂体炎，1例原发性CNS血管炎）。我们的发现与另一项研究结果一致且高度重叠，该研究在两个独立队列中量化了1,463种蛋白，强调RRMS患者CSF中FCRL5过表达，但血清中无。

可溶性FCRL5最初于2007年被描述在多发性骨髓瘤和其他淋巴增生性疾病患者血清中过表达，其作用仍未知。建议这种可溶性形式可能来自FCRL5 mRNA的选择性剪接，该机制可产生三种异构体：一种GPI锚定型，一种分泌型，和跨膜型。然而，FCRL5也可能来自其跨膜形式的脱落。该受体已知结合IgG和热聚集IgG，但尚未报道其他配体。

在细胞水平，FCRL5是一种泛B细胞标志物，在B细胞成熟所有阶段弱表达，但主要在DN和atMBC上丰富表达。尽管强表达FCRL5的这些B细胞亚群在多种自身免疫病中上调，但其功能和致病机制在这些不同条件下是否相同仍未知。据报道，在MS背景下，它们有助于诱导T细胞反应和产生促炎细胞因子，其在MS患者CSF中的比例增加。

尽管反映CNS中B淋巴细胞存在的其他标志物如OCB和IgG指数通常在诊断时测量，但我们的研究表明CSF中FCRL5浓度与OCB存在无关。如在OIND患者中所示，仅4例FCRL5水平高于LLOD患者中的2例有阳性OCB。类似地，尽管几乎所有MS患者有阳性OCB（98%），仅62.5%有FCRL5水平高于LLOD。这些发现表明FCRL5可能特异性突出OCB产生细胞的一个亚群或不同的CNS驻留B淋巴细胞群体。关于测量FCRL5 CSF水平的预后相关性，应注意在我们队列中，IgG水平和IgG指数与随访期间发生新T2/FLAIR MRI病灶的较高风险无关，而较高FCRL5水平相关。

MS患者CSF中FCRL5浓度高于OIND患者，支持FCRL5表达细胞可能更特异性参与MS发病机制的作用。新MRI病灶发生与CSF FCRL5水平的关联表明其作用可能有害且与炎症放射学疾病活动相关。出乎意料的是，我们发现MS患者血清FCRL5水平与皮质和近皮质病灶负荷呈负相关。在此背景下，已有描述从MS患者分离的PBMC提取的FCRL5 mRNA水平与MRI评估的脑萎缩和T1低信号病灶呈负相关。这种负相关需要进一步研究，但可能由该细胞池从外周迁移到CNS建立驻留的倾向解释，特别是形成异位脑膜滤泡，因为我们未在配对样本中观察到CSF和血清FCRL5浓度的任何相关。此外，