细胞收缩力介导的形态发生组织工程：基于4D打印可降解水凝胶支架的创新策略

本研究开发了一种创新的4D生物打印平台，利用细胞收缩力（CCF）作为核心驱动力，通过可降解氧化甲基丙烯酰化藻酸盐（OMA）微凝胶与明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）复合生物墨水，实现了细胞负载支架的程序化形状变形。该平台在维持结构稳定性的同时，通过快速降解放大细胞间相互作用，最终形成无支架的生物组织构造，为仿生组织工程和动态形态发生研究提供了突破性解决方案。

　　

水凝胶生物墨水的配方与流变学特性

研究团队设计了一种基于氧化甲基丙烯酰化藻酸盐（OMA）微凝胶的复合生物墨水体系。OMA具有光交联特性、高细胞相容性和可调节降解性，其微凝胶平均直径为129±68μm。为增强细胞与基质相互作用，在体系中加入了3% w/v的明胶甲基丙烯酰胺（GelMA），该成分含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）等生物活性基序，能有效促进细胞粘附。

流变学测试显示，该复合生物墨水在0.1%应变下表现出显著的固体样特性，储能模量（G′）远大于损耗模量（G″）。在20%应变时出现G′和G″的交叉点，表明材料从固体样向液体样状态转变。复合粘度-剪切应变曲线显示从4%应变开始粘度逐渐降低，而粘度-剪切速率曲线显示随着剪切速率增加粘度持续下降。通过Power-Law拟合得到流动指数（n）为0.26，稠度指数（K）为21.66，证实了墨水的剪切稀化行为。

循环剪切应变测试表明，该生物墨水在1%和100%应变交替作用下能快速恢复初始结构状态，经过四个循环后仍保持一致的恢复能力，展示了优异的自愈合性能。使用22号针头（内径413μm）进行挤出打印时，能产生均匀细丝，在x、y和z轴上的尺寸精度达到101%-106%。金字塔、立方体和圆柱体等大型水凝胶构造在紫外交联前后都表现出卓越的结构稳定性。

3D打印水凝胶构造的力学特性与降解行为

研究人员打印了20×20×1.0mm的水凝胶板，经光交联（15秒，6.7mW cm^?2）后冲压成多个水凝胶圆盘（d=8mm）进行测试。动态力学分析显示，新制备的OMA和OMAGM水凝胶都表现出频率无关的储能模量（G′），这是化学交联水凝胶的典型特征。OMAGM水凝胶的G′低于OMA水凝胶，表明GelMA的加入导致了更柔软的水凝胶。

在37°C细胞扩增培养基中孵育4小时后，两种水凝胶都达到溶胀状态，G′显著降低并转变为强烈的频率依赖性。溶胀的OMAGM水凝胶的G′降至200Pa以下，低于大多数软组织的弹性模量，这种刚度降低有利于细胞介导的收缩。紫外交联时间增加能增强化学交联，显著提高水凝胶刚度。选择15秒紫外交联时间产生了脆弱但结构完整的水凝胶基质，G′低于20Pa。

降解测试显示，用15秒紫外交联制备的OMAGM水凝胶在培养基中培养4天内快速降解，而延长紫外暴露时间则减慢了降解速率。这种快速降解不仅弱化了水凝胶基质，还为增强细胞间相互作用创造了空间，可能通过增加细胞牵引力来增强CCF收缩水凝胶基质的能力。

活细胞在驱动4D形状转变中的作用

研究使用NIH3T3成纤维细胞作为模型，因其快速增殖和收缩水凝胶构造的能力。实验设置了三个组：OMA、OMAGM和装载死细胞的OMAGM对照组，细胞密度均为1×10⁸ cells mL^?1。培养4小时后的活/死染色显示，OMA和OMAGM构造中的细胞存活率高，而死细胞对照组完全无活性。

视觉观察显示，含有活细胞的OMA和OMAGM圆盘构造逐渐向上卷曲形成碗状结构，而死细胞对照组和无细胞构造在整个培养期间保持平坦形状，最终因水凝胶降解而坍塌。活/死染色显示，随着培养时间从D0延长到D14，细胞密度显著增加并形成密集的细胞网络。H&E染色显示，OMAGM构造中的细胞逐渐形成良好组织结构，D14时无残留水凝胶可视化，表明只有细胞和ECM保留。

有趣的是，构造边缘的细胞显得更加密集组织，这可能有助于沿径向方向的差异收缩，从而导致观察到的卷曲现象。量化变形数据显示，OMAGM构造比OMA构造表现出更快速和显著的收缩，而死细胞构造则表现出体积膨胀而非收缩。

F-肌动蛋白和E-钙粘蛋白染色分析

细胞收缩力主要由细胞内的肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架机制产生。鬼笔环肽染色显示，在D0时细胞呈圆形且均匀分散，F-肌动蛋白染色弱且无组织。随着培养时间推移，细胞密度逐渐增加，从圆形转变为伸长形态，并出现良好排列的细胞排列。在D10和D14时，特别是在构造外围观察到强烈且极化的F-肌动蛋白染色，表明可能存在升高的各向异性CCF生成和协调的细胞骨架重塑。

同时，通过E-钙粘蛋白的免疫荧光染色评估细胞间粘附。最初细胞显示稀疏的E-钙粘蛋白表达和分散分布。随着时间的推移，表达增强并更加定位在组织边缘，与细胞排列和压缩成网络样结构并行。这些发现进一步支持协调的细胞间粘附在集体力生成和组织形态动力学中的作用。

F-肌动蛋白和E-钙粘蛋白随时间的动态重组反映了构造内结构化机械各向异性的出现。由F-肌动蛋白和E-钙粘蛋白机制调节的CCF被传递到周围的ECM和邻近细胞，驱动全局水凝胶变形，并有助于观察到的4D形状变形。

细胞密度、水凝胶刚度和构造尺寸对形状变形能力的影响

研究调查了细胞密度（20-200M cells mL^?1）、水凝胶刚度（光交联时间15-60秒）和构造尺寸（直径和厚度）对形状变形的影响。细胞密度为20、50和100M cells mL^?1的构造显示细胞保留增加，而200M cells mL^?1的构造显示细胞保留显著减少，可能是由于聚合物网络无法充分包裹细胞。

20M cells mL^?1的构造在D3时坍塌，无法保持完整性，而50和100M cells mL^?1的构造保持结构，50M cells mL^?1的构造表现出更大的变形。但由于脆弱性，确定100M为后续研究的最佳密度。

更长光交联时间的构造表现出增加的刚性，因此具有30和60秒光交联的细胞负载构造在两周培养期间显示最小收缩和有限向上弯曲。有趣的是，在前5天，15秒光交联的构造比30和60秒的构造收缩更少，这归因于15秒构造的更高初始溶胀，导致更大的体积扩张。D5后，CCF在15秒构造中引起显著收缩，导致更小的构造尺寸和比30秒和60秒构造更显著的变形。

在不同直径的构造中，8mm构造在D8后表现出比6和12mm构造更大的收缩，并在D14保持碗状形状。6mm构造在D14形成无明确形状的细胞簇。在不同厚度的构造中，最小厚度0.6mm的构造显示出最显著和快速的收缩和变形，但到D14时这些构造失去形状，形成细胞簇。相比之下，1.0和1.2mm构造在D14保持良好定义的碗状形状。

初始几何形状对形状变形能力的影响

研究通过改变初始几何设计调查了CCF是否能有效驱动形状变化形成不同的复杂架构。条带形状构造弯曲成"C"模式，在D7达到峰值曲率，随后在D14部分放松。片状构造卷成管状形式，而4臂抓取器几何形状向内卷曲，产生花状配置。星形构造观察到类似的变形过程。

研究的各种图案，包括网格、蜂窝和螺旋状，对细胞负载构造的形状转变没有明显影响。这种缺乏区分可能归因于使用的打印条件，特别是60%填充密度和22G针头，所有细丝在打印过程中合并，导致没有可辨别的内部图案。这些结果强调了利用初始几何设计通过CCF驱动的形状变形生成复杂组织的潜力。

4D组织工程应用

在人体中，组织发展与形态进化固有相连，通过动态变形过程形成特定架构。研究人员使用人间充质干细胞（hMSCs）打印细胞负载构造，然后在组织特异性环境中培养以促进谱系特异性组织成熟。

在软骨形成研究中，使用简单条带形状原型（称为Exp组）在软骨分化培养基中诱导hMSC软骨形成以设计软骨样组织。对照组（Ctrl）保持在正常生长培养基中。在培养期间，Ctrl和Exp构造都表现出连续的形态进化，Exp构造比Ctrl组表现出更快速和显著的体积收缩。到D10，Exp构造从"C"形状转变为"肾豆"形状，而Ctrl构造保持其"C"几何形状。Exp组更显著的几何变化可能归因于分化的软骨细胞比Ctrl组中未分化的hMSCs施加更强的CCF。

生化分析显示，与Ctrl构造相比，Exp构造中糖胺聚糖（GAG）产量 normalized to DNA含量（GAG/DNA）显著更高，表明在软骨形成培养基中有效的细胞分化驱动了强劲的软骨形成。这些发现通过使用萨夫兰素O（SafO）和甲苯胺蓝O（TBO）染色的组织学分析得到证实。

成骨分化研究进一步验证了骨组织的CCF-4D工程。在培养基中培养的构造在21天内显示渐进形状变化。它们在D6形成明显的"C"形状。然而，Ctrl构造到D14时失去了这种几何特征，而Exp构造经历了显著收缩，保留了一个小的"C"形状。经历成骨分化的Exp构造在整个培养期间表现出比Ctrl组更不显著的弯曲角度，可能归因于矿化ECM的产生，增加了组织刚性并快速平衡了细胞与其周围基质之间的应力。

D21的生化分析证实了在成骨培养基中的分化能力，与Ctrl组相比，Exp组中碱性磷酸酶（ALP）和钙水平显著升高，均 normalized to DNA含量（ALP/DNA和Ca/DNA）。使用H&E和茜素红S（ARS）染色的组织学评估进一步证明了Exp构造中更密集的组织组织和更强烈的红色染色，表明新骨样组织形成。

技术优势与创新意义

与主要依靠物理和化学刺激引发形状变形的传统4D系统相比，利用活细胞产生的生物力（如CCF）代表了仿生4D组织工程的重大进步。由于CCF固有的弱性，现有的CCF驱动4D系统通常需要超软水凝胶基质来实现可检测的形状变形。虽然这些软水凝胶有助于细胞力传递，但它们对形成稳定的独立结构构成挑战，需要使用机械支持来维持初始细胞负载构造的完整性。

为解决这些限制，本研究引入了机械自适应性水凝胶支架，包含牺牲性明胶微球。这种设计允许制造稳定的3D独立结构，随着明胶微球在培养过程中溶解而经历受控软化。这种渐进软化放大了CCF的影响，使得随时间发生显著的形状变形。虽然水凝胶材料在培养和分化过程中维持结构完整性方面起着关键作用，但它们的长时期存在可能干扰组织重塑并在体内应用时引入潜在的免疫毒性。

为解决这些挑战，研究团队开发了一种机械稳健但快速降解的水凝胶系统，支持稳定的3D打印，同时促进能够程序化4D形状变形的细胞凝聚物形成。在培养时，该系统能够形成复杂的细胞凝聚物架构，无残留水凝胶生物材料，提供了一个基于CCF的动态平台，紧密模拟天然组织发展的形态发生。

然而，在该系统中，变形方向性主要受板底施加的空间限制支配，缺乏精确控制变形方向的机制，从而限制了可实现形态的范围。在未来研究中加入信号分子或空间排列细胞位置可能提供调节CCF方向性的手段，实现更精确和可编程的形状变形，以更好地模拟复杂的形态发生过程。

这项研究代表了一种有前景的4D生物打印方法，通过利用细胞自身产生的机械力作为形状变形的主要驱动力，为创建动态组织模型提供了新途径，部分重现了天然形态发生过程。