线粒体伴侣蛋白GRP75乙酰化调控内质网-钙稳态与肝细胞胰岛素抵抗的新机制

本研究发现线粒体乙酰化调控蛋白GCN5L1通过介导线粒体伴侣蛋白GRP75在K567/K612位点的乙酰化修饰，调控IP3R1-GRP75-VDAC复合物组装，进而维持ER-线粒体钙稳态和胰岛素敏感性。该研究揭示了营养过剩条件下GCN5L1亚细胞定位改变通过GRP75去乙酰化诱发胰岛素抵抗（IR）的新机制，为2型糖尿病（T2D）提供了潜在治疗靶点。

　　

1 引言

胰岛素抵抗（IR）作为2型糖尿病（T2D）的核心特征，是改善糖尿病的重要靶点。肝脏在维持全身代谢稳态中起核心作用，其线粒体-内质网（ER）网络通过通讯调节葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。线粒体作为细胞能量工厂，通过线粒体相关内质网膜（MAMs）与ER物理连接，促进脂质、代谢物和钙转运以维持细胞器稳态。IP3R-GRP75-VDAC复合物作为重要的MAM栓系复合物，通过调节ER-线粒体钙流影响ER稳态和线粒体氧化应激。研究表明，MAM结构与高脂饮食（HFD）诱导的肝脂肪变性和IR密切相关。

肝脏胰岛素抵抗与线粒体蛋白乙酰化增加相关。营养过剩通过升高线粒体乙酰辅酶A水平促进蛋白乙酰化，进而改变线粒体功能和代谢。GCN5L1/BLOC1S1作为肝细胞中的营养传感器，参与调节线粒体蛋白乙酰化和内溶酶体生物学过程。GCN5L1肝脏敲除（LKO）小鼠显示线粒体蛋白乙酰化减弱，并对营养诱导的肝脏脂肪积累具有抵抗性。

2 结果

2.1 线粒体GCN5L1调节肝脏胰岛素信号和ER应激

棕榈酸（PA）处理降低原代肝细胞和HepG2细胞中GCN5L1表达，并抑制胰岛素刺激的Akt磷酸化。T2D患者肝脏活检标本显示GCN5L1表达降低。GCN5L1 LKO原代肝细胞显示胰岛素受体（IR）Y1146和Akt S473磷酸化减少。虽然GCN5L1缺失不影响线粒体呼吸和糖酵解速率，但增加ROS生成，而ROS清除不能恢复LKO细胞的胰岛素信号。有趣的是，GCN5L1 LKO肝细胞中ER应激标志物转录水平升高，线粒体限制性GCN5L1（MtG）表达可逆转这种ER应激并恢复胰岛素敏感性。ER应激抑制剂4-PBA和BiP inducer X可恢复GCN5L1 LKO肝细胞的胰岛素信号，表明ER应激介导了GCN5L1缺失诱导的IR。

2.2 GRP75作为GCN5L1缺失诱导肝胰岛素抵抗的潜在介质

通过蛋白质组学筛选发现GRP75与GCN5L1相互作用，且MtG诱导特异性增加GRP75上7个赖氨酸残基的乙酰化。Co-IP实验验证了GRP75与GCN5L1的相互作用，GCN5L1缺失降低GRP75乙酰化水平，而MtG过表达可恢复。GRP75作为线粒体伴侣蛋白，参与线粒体未折叠蛋白反应（UPR^MT）和MAM形成调控。研究发现GRP75敲低增强胰岛素信号并激活整合应激反应（ISR），提示GCN5L1可能通过调节GRP75乙酰化来调控ER-线粒体钙复合物活性。

2.3 线粒体GCN5L1调节ER-线粒体接触和钙流

GCN5L1 LKO肝脏粗线粒体组分中MAM标志物FACL4、MFN2和IP3R1水平增加，MtG表达可逆转这一现象。透射电镜（TEM）显示GCN5L1 LKO肝脏中MAM结构增多。MAM纯化证实IP3R1在LKO肝脏MAM中富集。钙成像显示GCN5L1缺失增强线粒体钙水平，MtG恢复可逆转细胞质和线粒体钙水平。

2.4 GCN5L1缺失通过扰乱ER-线粒体钙稳态降低肝细胞胰岛素信号

IP3R1或MCU敲低或用抑制剂（XC、Ru360）处理可恢复GCN5L1 LKO肝细胞的胰岛素信号和ER应激标志物表达。GCN5L1缺失损害胰岛素刺激的糖原和脂质合成，而IP3R1抑制可挽救这一缺陷。体内实验显示，正常饮食下LKO肝脏糖原含量降低，HFD喂养下LKO小鼠血浆胰岛素水平和HOMA-IR升高，胰岛素刺激的Akt磷酸化显著降低。MtG过表达增强HFD诱导IR小鼠的胰岛素敏感性。

2.5 GRP75 K567/612乙酰化调控IP3R1-GRP75-VDAC复合物组装

GRP75与IP3R1片段C和E有强亲和力，其N端（GRP75N）与VDAC结合，C端（GRP75C）与IP3R1结合。体外乙酰化实验显示GCN5L1促进GRP75C乙酰化。GRP75 K567/612去乙酰化模拟突变（2KR）增强与IP3R1的亲和力，蛋白酶K保护实验表明2KR突变体在MAM中定位增加。蓝 native PAGE分析显示GCN5L1 LKO肝细胞和GRP75-2KR过表达肝细胞中IP3R1-GRP75-VDAC复合物水平增加。GRP75-2KR突变在PA处理下加剧IR，而K135/138/206/288/300乙酰化对胰岛素敏感性无影响。

2.6 GCN5L1/GRP75轴通过调控ER-线粒体钙稳态在营养过剩诱导IR中起关键作用

HFD喂养不改变GRP75总蛋白水平，但增加其在MAM的定位，同时减少GCN5L1线粒体定位并增强其胞质定位。PA处理肝细胞和HepG2细胞重现这一现象。AAV-GRP75-2KR表达增加IP3R1在线粒体组分中的富集和与IP3R1的相互作用，增强线粒体钙流并降低胞质钙水平。正常饮食下GRP75-2KR和2KQ小鼠胰岛素敏感性无差异，但HFD喂养2周后，2KR小鼠出现显著IR和ER应激基因表达增加。GRP75-2KR原代肝细胞显示胰岛素信号减弱，PA处理加剧这一现象。

3 讨论

本研究揭示了线粒体乙酰化调控蛋白GCN5L1在维持肝脏胰岛素敏感性中的关键作用。通过蛋白质组学和乙酰化组学分析，发现GRP75 K567/612乙酰化是GCN5L1调控的新靶点。机制上，GCN5L1缺失或HFD诱导的GCN5L1线粒体外排导致GRP75去乙酰化，促进IP3R1-GRP75-VDAC复合物组装，增强ER-线粒体钙流，诱发ER应激和IR。GRP75-2KR突变模拟去乙酰化促进IR，而2KQ突变则具有保护作用。该研究首次揭示了GCN5L1亚细胞定位变化通过GRP75乙酰化调控胰岛素敏感性的新机制，为T2D治疗提供了新靶点。

4 实验方法

研究使用GCN5L1肝脏特异性敲除小鼠（LKO）和flox/flox对照小鼠。通过AAV病毒尾静脉注射实现基因在肝脏的过表达。采用原代肝细胞培养、蛋白质组学分析、Co-IP、免疫印迹、钙成像、线粒体功能分析、TEM、蓝 native PAGE等技术。统计学分析使用GraphPad Prism 9，数据以均值±标准误表示，p<0.05认为有统计学意义。