靶向G3BP1的原花青素B3及其衍生物通过稳定应激颗粒抑制神经元凋亡以治疗缺血性脑卒中

本研究采用化学蛋白质组学策略，发现原花青素B3（PB3）通过靶向Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白1（G3BP1）发挥神经保护作用。机制研究表明，PB3通过与G3BP1的NTF2L结构域结合，抑制应激颗粒（SG）降解，减少氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）诱导的神经元凋亡。研究团队进一步设计合成了14种PB3衍生物，其中化合物6c表现出优异的神经保护活性和血脑屏障（BBB）通透性。该工作不仅揭示了G3BP1作为缺血性脑卒中（IS）治疗新靶点的潜力，更为开发基于PB3结构的神经保护剂提供了重要理论依据和化学模板。

　　

1 引言

缺血性脑卒中（IS）是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，约占所有卒中病例的80%。目前临床治疗策略包括溶栓、抗血小板、改善微循环和神经保护等，但仍缺乏特异性靶向药物。应激颗粒（SG）是真核细胞响应应激条件形成的动态可逆细胞质凝聚体，由mRNA、mRNA结合蛋白、40S核糖体亚基和翻译起始因子组成。在脑缺血过程中，SG在应激开始时快速组装，并在再灌注后解离。Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白1（G3BP1）作为SG蛋白-蛋白相互作用网络的核心，在SG形成和降解过程中起关键作用。

原花青素低聚体在自然界中广泛分布，其中原花青素B3（PB3）已表现出显著的神经保护特性，包括保护PC12细胞和在帕金森病斑马鱼模型中保留多巴胺能神经元。此外，PB3还能减轻β淀粉样蛋白诱导的神经毒性，表明其作为中枢神经系统疾病治疗剂的潜力。

2 结果与讨论

2.1 PB3在IS体内外模型中的神经保护作用

研究团队首先在HT22细胞中建立了OGD/R模型，发现PB3在20-400 μM浓度范围内能显著提高细胞存活率。TUNEL染色和免疫印迹分析表明，PB3剂量依赖性地降低TUNEL阳性细胞率，上调Bcl-2表达，下调cleaved caspase-3表达。在瞬时大脑中动脉阻塞（tMCAO）小鼠模型中，腹腔注射48 mg·kg^-1 PB3能改善神经功能缺损评分，减少脑梗死体积，降低细胞凋亡水平。这些结果表明PB3在体内外均能保护神经元，发挥抗缺血性脑卒中作用。

2.2 G3BP1作为抗IS小分子PB3的细胞靶点

通过化学蛋白质组学分析，研究团队发现G3BP1是PB3的关键作用靶点。表面等离子体共振（SPR）分析显示PB3直接与G3BP1结合（K_D = 44 nM），细胞热位移实验表明PB3增强了G3BP1的热稳定性。研究人员进一步合成了PB3-苯酚酮探针（PB3-BP），通过pull-down实验验证了PB3与G3BP1的特异性结合。LC-MS/MS分析确定PB3结合位点位于G3BP1的NTF2L结构域R107位点附近，分子对接预测PB3与Leu105、Arg107、Gln134和Asp135等残基相互作用。

通过siRNA敲低G3BP1表达后，PB3的神经保护和抗凋亡作用被显著抑制，证实了G3BP1在PB3抗IS效应中的关键作用。

2.3 PB3在IS体内外模型中调节SG水平

作为SG网络的核心节点，G3BP1对SG的形成和降解至关重要。研究发现PB3能剂量依赖性地增强HT22细胞中SG水平。在OGD/R模型中，PB3处理24小时后SG阳性细胞比例显著增加，但在处理后1小时没有明显变化，表明PB3主要抑制SG降解而非促进其形成。RT-qPCR分析显示，PB3处理组中eIF2α磷酸酶（GADD34和PPP1R15B/CReP）表达显著降低，而eIF2α激酶（PERK和GCN2）表达显著升高。RNA免疫沉淀（RIP）实验表明，PB3增强了G3BP1与mRNA的结合能力，为PB3稳定SG提供了额外证据。

在tMCAO小鼠模型中，PB3处理同样显著增强了缺血皮层中的SG水平，这与体外实验结果一致，初步解释了PB3抗IS的作用机制。

2.4 PB3衍生物的设计、合成及体外神经保护作用

考虑到PB3含有大量羟基，其血脑屏障（BBB）通透性可能受限，研究团队通过结构修饰增强PB3的亲脂性。基于PB3合成中间体4，通过Suzuki反应引入不同取代基，经氢解得到PB3衍生物6a-6h。此外，还通过羟基衍生化合成了乙酰化产物8、全甲基化产物9以及选择性甲基化衍生物13a-13d。

通过评估这些化合物在OGD/R损伤下的神经保护作用，发现C8位取代的PB3衍生物中，异丙基取代的化合物6c表现出最佳的神经保护活性。体外BBB模型实验表明，6c的转运效率优于PB3。进一步研究发现，6c在50 μM浓度下能降低TUNEL阳性细胞率，上调Bcl-2表达，下调cleaved caspase-3表达，抗凋亡活性优于PB3和阳性对照药物依达拉奉（EDA）。SPR分析显示6c与G3BP1相互作用（K_D = 58 nM），分子对接表明6c与PB3具有相似的结合模式。

2.5 优选化合物的体内评价

初步体内筛选显示，化合物6c在tMCAO模型中能显著改善神经功能缺损，减少约30%的脑梗死体积，效果优于PB3和6b。剂量效应研究表明，48 mg·kg^-1 6c表现出最佳的神经保护活性。长期神经功能恢复评估表明，6c治疗能减轻tMCAO小鼠的体重下降趋势，改善改良神经严重程度评分和旋转棒测试表现。此外，6c还能在体内介导SG上调，证实其作用机制与PB3相似。

药代动力学研究显示，6c的脑血浆浓度比为0.57，高于PB3的0.37，表明其BBB通透性得到改善。虽然6c的体内代谢较快，但其代谢物可能仍保留神经保护活性。

3 结论

本研究通过化学蛋白质组学策略发现G3BP1是PB3抗IS作用的关键靶点。机制研究表明，PB3通过靶向G3BP1抑制SG降解，减少神经元凋亡，从而发挥神经保护作用。通过结构修饰获得的优选化合物6c表现出增强的神经保护活性和BBB通透性，且作用机制与PB3相似。靶向G3BP1为IS治疗提供了新的机会，PB3及其衍生物的开发为IS神经保护剂的发现提供了新思路。

4 实验部分

详细描述了化学合成方法、细胞培养、OGD/R模型建立、动物实验、细胞活力检测、细胞凋亡分析、免疫印迹分析、脑梗死体积评估、免疫荧光分析、PB3探针制备与鉴定、靶点蛋白富集、LC-MS/MS检测、SPR分析、细胞热位移实验、分子对接与分子动力学模拟、siRNA转染、RT-qPCR、RIP实验、BBB通透性评估、长期神经功能恢复评估以及药代动力学研究等方法。所有实验均进行至少三次独立重复，统计学分析使用GraphPad Prism软件进行。