空间适应性生物催化：亚胺还原酶介导的动态动力学解析用于受阻联芳胺的阻转选择性合成

本综述系统介绍了亚胺还原酶（IRED）介导的动态动力学解析（DKR）策略在合成具有空间位阻的联芳胺类阻转异构体中的突破性应用。该研究通过酶的空间适应性机制，成功实现了对萘、喹啉等大位阻（杂）芳基骨架的高效、高选择性（高达99%产率，99% ee）催化转化，并创新性地开发了借氢级联系统直接从外消旋醇合成目标产物。结合密度泛函理论（DFT）计算与分子动力学（MD）模拟，深入阐释了DKR过程、酶选择性及底物-酶相互作用机制，为绿色生物催化合成轴向手性分子提供了新范式。

　　

引言

在不对称化学领域，手性胺的合成一直备受关注。尽管化学酶法合成各类手性胺取得了显著进展，但酶对底物或中间体的识别特异性及选择性仍存在巨大挑战。其中，亚胺还原酶（IREDs）家族因其能够通过NAD(P)H依赖的方式不对称还原亚胺，在C─N键中构建手性中心，在手性胺合成中脱颖而出。

阻转异构联芳胺作为许多天然产物和手性药物中的优势骨架，具有重要价值。II/III型阻转异构体因邻位大位阻取代基或扩展芳香体系（如萘基）而呈现受限旋转（ΔG^? >20 kcal mol^?1），其半衰期从分钟到年不等。这种轴向手性在著名药物和潜在分子构建中扮演着关键角色，如抗HIV药物michellamine B、糖肽抗生素万古霉素、抗糖尿病候选药物BMS-767778等。此外，阻转异构联芳胺还可作为不对称催化中的多功能配体，如BINAM和NOBIN衍生物。

尽管金属或有机催化策略已广泛用于构建阻转异构联芳胺，但随着绿色化学的兴起，酶催化因其高效性、选择性、可变性和重现性而成为一种环境友好且可持续的策略。然而，由于结构限制，酶通常对非天然底物，尤其是具有空间位阻的底物效果不佳，往往需要广泛的酶工程来增强其适应性。

酶优化

本研究选择具有空间位阻的联芳醛1a作为模型底物，基于收集的50种IREDs进行了初步筛选。结果显示，仅有八种酶能检测到目标产物3a，且具有较好的对映选择性（65–96% ee，兼具R和S选择性）。其中，IR-09、IR-16和IR-114表现出超过90%的R选择性。由于R型阻转异构体在IRED催化中尚未得到充分探索，本研究优先对来自Aspergillus lentulus的IR-09进行了系统评估，包括胺当量、温度和缓冲液pH等参数。最终，在NADP⁺/GDH/葡萄糖循环系统中，使用8当量炔丙胺（2a）和纯化IR-09（0.2 mol%），在Tris-HCl缓冲液（100 mm，pH 8.0）中，以0.05 mmol底物1a规模，成功合成了产物3a，产率82%，对映异构体过量（ee）达96%。

底物耐受性测试

在IR-09的推动下，本研究进一步探索了该生物催化系统的底物适用性。首先，评估了多种带有萘环的空间位阻联芳醛。IR-09对萘酚-苯酚或苯-萘酚醛底物3a–e均表现出稳健的对映选择性（96–>99% ee）。然而，对于具有更大官能团的底物，如带有-ⁱPr的3c和带有-Et的3e，IR-09的催化能力未充分展现（产率分别为21%和46%）。对于双萘底物3f，尽管立体选择性满意（96% ee），但转化率进一步降低（33%），这可能归因于更高的旋转能垒（ΔG^? = 26.3 kcal mol^?1）。尽管过度的空间位阻可能降低反应性，但相对的位阻对于适应酶的构象转化至关重要。

产物3g由于位阻较小的联苯而表现出中等产率和ee值，而溴代联苯类似物3h,i则显示出更高的产率和优异的立体选择性（98% ee）。从3h（52%）到3i（68%）的产率提升表明底物足够空间位阻的重要性。通过X射线单晶衍射分析，产物3h被确定为(S)-对映体。这些结果表明，酶内部存在一个相当大的口袋来容纳芳基，因为庞大的芳环更有利于底物识别。

随着芳环的良好生物转化，本研究进一步将目标扩展至杂环芳环和萘-喹啉底物。引入杂环芳环后，大多数产物从5a到5m均表现出优异的立体选择性，而产物5n（60% ee）和5o（89% ee）的表现不佳，可能由于N-杂芳环与NADPH相互作用的消失。对于5a–e的转化，所有产物均以68–99%的产率交付了优异的结果，特别是被-NO₂和-F等吸电子基团修饰的萘-喹啉底物。然而，甲基的添加可能阻碍底物与酶之间的识别和相互作用，导致5f的产率一般。在喹啉C-4位添加给电子基团也会削弱该酶系统，如5g的产率仅为27%。此外，与带有萘环的底物（5a–g）相比，苯基衍生物（5h–l）保持了高产率（60–>99%）和高ee值（98–>99%），这表明萘骨架在该系统中可能并非必需。

随后，评估了IR-09对不同胺的兼容性。除炔丙胺（2a）外，线性胺如烯丙胺（2b）和3-丁炔胺（2c）可有效用于胺化过程，产物6a,b的产率达97%，ee值>99%，而三氟丙胺（2d）的反应性有限（6c，产率54%，ee >99%）。环胺如环丙基（2e,f）、环丁烯（2g）和杂环丁烯变体（2h–j）交付了6d–i，ee值优异（>99%），但产率在54%至96%之间波动。然而，庞大的脂肪族/芳香族胺由于冗余的空间位阻而不被接受。通过X射线单晶衍射确定了(S)-6i的绝对立体构型，其他产物5a–o和6a–h的构型通过类比暂定。

产物衍生化

为扩展该酶策略的应用，在1 mmol规模上成功执行了4a与2b之间的模型反应，以71%的产率和99%的ee值交付了6a。随后，6a的烯丙基脱保护生成了伯胺7a，并通过与苯基（8a）、苄基（8b）和脂肪族亲电试剂（8c）的交叉偶联进一步多样化（产率28–51%）。该方法成功合成了与标准酶反应不兼容的阻转异构联芳胺产物。随后，通过一步转化，伯胺7a被有效转化为喹啉-硫脲结构8d，这是一种手性双功能催化剂，兼具Lewis碱和氢键部分。胺7a还可与阿司匹林和萘普生衍生化为酰胺产物8e,f。值得注意的是，所有产物的构型均完全保持（>99% ee）。类似地，在1 mmol规模上实现了1d向联芳胺3d的转化，立体选择性保持（92% ee），产率81%。经过乙酰化和与抗HIV核苷药物齐多夫定的点击反应两步，成功获得了联芳-核苷偶联物10（两步总产率63%，91% de）。

借氢级联反应研究

基于对IREDs的基础研究，进一步测试了通过借氢级联系统直接将外消旋醇转化为手性胺的潜力。该反应依赖于醇和亚胺之间通过醇脱氢酶（ADH）或酮还原酶（KRED）和IRED驱动的NAD(P)⁺/NAD(P)H的氢迁移，无需外部GDH和葡萄糖循环。由于外消旋醇的氧化需要使用非对映选择性ADH或KRED来转化外消旋醇，进行了广泛筛选。在40种酶中，来自Exiguobacterium sp. MH3的KRED-F42被发现能有效转化醛和外消旋醇，但根据级联系统中的较差反应性和底物耐受性，其与IR-09的匹配度不佳。因此，执行了酶工程以提升KRED-F42的反应性。基于FRISM策略，对酶活性位点3 ?内的七个残基进行了突变以评估其性能变化。在突变体中，获得了潜在候选KRED-F42-T244L，其能以外消旋醇从醛中高效生产。进一步优化了与IR-09和F42-T244L的级联反应条件，包括酶负载量、胺和NADP⁺的浓度。最终，模型产物(S)-5h以55%的产率（三次平行实验的平均值）和98%的ee值获得，证明了通过借氢级联系统生产阻转异构联芳胺的成功。底物研究表明，几种联芳骨架和胺伙伴可成功转化为具有中等产率和优异ee值的产物。未来的进一步工程努力可能有助于提升反应效率。

机制研究

为阐明DKR过程的机制，进行了密度泛函理论（DFT）计算以评估各种底物及其相应亚胺中间体的旋转能垒。结果显示，不同类型的底物经历不同的外消旋化路径。对于酚-萘醛底物1a，其半缩醛形式1a的旋转自由能垒在环境温度下为26.2 kcal mol^?1，而由1a和炔丙胺2a原位形成的N,O-缩醛中间体的旋转能垒显著较低，为13.3 kcal mol^?1。这表明不稳定的亚胺中间体有利于IRED催化的阻转选择性DKR过程。对于位阻更大的底物1f，也观察到类似现象，其中中间体的旋转能垒低于起始材料。对于含喹啉的联芳底物如4h，由底物衍生的瞬态Lewis对的旋转自由能垒为24.9 kcal mol^?1，而亚胺中间体的旋转能垒较高，为31.0 kcal mol^?1。这表明IRED催化的阻转选择性合成是通过底物自身的外消旋化发生的。对于喹喔啉4m和苯并呋喃联芳底物4n，也观察到相同的外消旋化机制，其中中间体的旋转能垒高于起始材料。然而，对于含苯并噻吩的联芳底物4o，其底物和亚胺中间体均表现出非常高的旋转能垒（分别为32.6和32.8 kcal mol^?1）。这种高能量要求使得DKR过程不可行，导致通过KR的产物5o产率较低。

为阐明亚胺还原酶IR-09实现高对映选择性的分子基础，使用代表性底物1a和4h衍生的亚胺中间体进行了对接和分子动力学（MD）模拟。分析显示，IR-09具有高度灵活的结合口袋，通过动态结构适应来容纳庞大底物。结合亚胺中间体后，环区域（loopα8'α9'，loopβ6'β7'）发生显著构象重排，口袋入口处的残基（Y211'，M208'）发生旋转调整，为亚胺复合物创造空间。对于1a衍生的亚胺中间体，(R)-3aI对映体稳定占据结合口袋，其羟基与NADPH的酰胺部分形成水介导的氢键。相反，(S)-3aI对映体缺乏这种稳定相互作用，因为其羟基朝向远离NADPH。这种差异导致(R)-3aI比(S)-3aI更接近NADPH（分别为5.3 ?和6.4 ?），从而促进了更高效的氢化物转移，并合理化了观察到的对映选择性。类似地，(S)-5hI中间体与NADPH紧密结合（4.7 ?），通过NADPH酰胺基团与(S)-5hI的喹啉和亚胺部分之间的氢键稳定。相反，(R)-5hI对映体由于缺乏这些稳定相互作用而距离NADPH较远（6.7 ?）。这些计算结果表明，对映选择性由亚胺中间体与NADPH酰胺基团之间的特定氢键相互作用控制。两种底物的氢化物从相同方向攻击，且带有极性官能团。但基于取代基优先顺序规则，手性应相应地为R和S。

对IR-09-(R)-3aI和IR-09-(S)-5hI复合物中结合口袋残基的进一步分析显示，L171和Y175分别位于亚胺基团及其 attached 芳环附近。这些残基可能在将亚胺基团导向NADPH中发挥关键作用，动态交叉相关分析（DCCA）证明了这一点，其显示了亚胺中间体与L171/Y175之间的相关运动（相关系数>0.55）。值得注意的是，这些残基的丙氨酸取代导致产率显著降低，进一步证实了它们的关键作用。此外，发现D167与亚胺氮形成水介导的氢键网络，表明其在还原反应中促进质子转移的潜在作用。D167A变体的活性显著减弱支持了这一机制见解。其他周围残基W204'、M208'、Y211'、S229'和Q234'与亚胺中间体的相关性较低（相关系数<0.35），其丙氨酸突变对反应性和ee的影响较小。

结论

总之，本研究开发了一种通过IRED催化的DKR过程生物催化合成阻转异构联芳胺的新方法，其能适应包括萘、喹啉或相关杂芳烃在内的极大庞大联芳烃，以优异产率和立体选择性构建了萘基-芳基胺和喹啉-芳基胺。基于高度灵活的结合口袋，所选底物通过IR-09介导的DKR过程转化为联芳产物，MD模拟验证了这一点。根据KRED-F42-T244L和IR-09的借氢级联，也成功探索了具有优异对映选择性的阻转异构联芳胺。研究表明，生物催化剂具有根据特定固有特性和结构灵活性接受挑战性非天然底物的潜力。进一步研究包括酶的应用和修饰，以及联芳胺的生物活性评估，结果将在不久的将来公布。