植物乳杆菌K014基于植物蛋白发酵培养基优化及其抗痤疮角质杆菌无细胞上清液的制备与特性研究

本研究针对传统痤疮治疗方法的局限性，探索了植物乳杆菌K014在植物蛋白发酵培养基中产生的无细胞上清液(CFS)对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。通过响应面法优化获得最佳培养基配方（35 g/L糙米蛋白+15 g/L酵母提取物+30 g/L乳糖），其冻干产物LCFS K014表现出优异的热稳定性（60-121°C）和pH稳定性（pH 2-5），MIC50和MIC90分别为12.5 mg/mL和25 mg/mL。该研究为开发天然、稳定、适合纯素护肤的抗痤疮制剂提供了新策略。

　　

痤疮 vulgaris（acne vulgaris）作为全球最常见的炎症性皮肤病，困扰着超过85%的青少年和年轻成人群体。它不仅带来红肿、疼痛的皮肤损害，更可能引发焦虑、抑郁等心理问题，严重影响着患者的生活质量。传统疗法虽然广泛使用，却面临着严峻挑战：抗生素的滥用导致耐药性不断增强，而苯甲酰过氧化物、水杨酸等非抗生素成分又容易引起皮肤干燥、红斑和刺激，特别是对敏感肌肤人群十分不友好。

在这一背景下，消费者对天然、温和且符合纯素理念的护肤解决方案的需求日益增长。科学家们开始将目光投向具有"益生"特性的微生物代谢产物——特别是乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）发酵后产生的无细胞上清液（Cell-Free Supernatant, CFS）。这些上清液中富含有机酸、细菌素（bacteriocins）、胞外多糖等多种活性物质，能够通过降低pH值、破坏细菌膜结构等多种机制抑制痤疮元凶——痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）的生长。

然而，目前乳酸菌发酵通常使用的MRS培养基中含有动物来源成分（如牛肉浸膏和蛋白胨），这与纯素和可持续的护肤理念相悖。因此，开发基于植物蛋白的发酵培养基，不仅能够满足伦理和市场需求，还可能通过优化培养基组成增强抗菌代谢物的产量。

在这项发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》的研究中，马来西亚理科大学的研究团队系统评估了植物乳杆菌K014（Lactiplantibacillus plantarum K014）在多种植物蛋白培养基中发酵产生的CFS对痤疮丙酸杆菌的抑制效果，并通过优化工艺显著提升了其抗菌活性，为开发新一代抗痤疮制剂奠定了坚实基础。

研究人员主要采用以下关键技术方法：首先通过琼脂扩散法从10株LAB中筛选出对痤疮丙酸杆菌抑制效果最强的菌株；接着以五种植物蛋白（鹰嘴豆、绿豆、豌豆、糙米和大豆分离蛋白）替代传统MRS中的动物成分，评估其发酵效果；进而采用响应面法（RSM）与中心复合设计（CCD）优化培养基中糙米蛋白、酵母提取物和乳糖的配比；对优化后获得的CFS进行冻干处理，得到Lyophilized CFS（LCFS）；最后通过微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），并系统评估LCFS的热稳定性、pH稳定性及酶稳定性。实验数据采用Design Expert和SPSS软件进行统计分析，所有实验均设三次重复。

研究结果方面：

Preliminary Screening of Different LAB Strains

在初步筛选中，10株LAB中的6株显示出对痤疮丙酸杆菌的抑制活性，其中植物乳杆菌K014表现最佳，抑菌圈直径达到23.67±0.58 mm，显著高于其他菌株（如短乳杆菌C23为19.33 mm，罗伊氏乳杆菌BM5为19.00 mm）。该结果通过单因素方差分析与Tukey事后检验证实具有统计显著性（p<0.05），表明K014在产生抗菌物质方面具有突出潜力。

Effect of Different Plant-Based Protein in Fermentation Medium

在植物蛋白培养基评价中，糙米蛋白培养基产生的CFS抑菌效果最强（16.00±2.00 mm），接近传统MRS培养基（17.33 mm），而大豆蛋白培养基则无任何抑制活性。通过凯氏定氮法测定各植物蛋白的蛋白质含量并结合散点图分析，发现蛋白质含量与抑菌活性无直接相关性，高蛋白底物反而可能抑制活性代谢物的生成。糙米蛋白因其低致敏性和无抗营养因子被选为后续优化基础。

Optimization of Plant-Based Protein Fermentation Medium

通过CCD设计20组实验，建立了抑菌圈直径（Y）与糙米浓度（A）、酵母提取物（B）和乳糖（C）的二次回归模型：Y = 21.44 + 0.29A + 0.29B + 0.42C - 0.71A2 - 0.46B2 - 0.46C2 - 0.5AB - 0.5AC + 0.5BC。模型具有高度显著性（p<0.0001），R2为0.9941，优化得到最佳配方：35 g/L糙米、15 g/L酵母提取物、30 g/L乳糖，预测抑菌圈为21.44 mm，验证实验结果为21.67 mm，误差仅1%，证实模型可靠。

Characterization of LCFS

MIC and MBC

冻干后的LCFS对痤疮丙酸杆菌表现出浓度依赖性抑制，MIC₅₀和MIC₉₀分别为12.5 mg/mL和25 mg/mL，MBC为50 mg/mL。在400-100 mg/mL浓度下可完全杀菌，25 mg/mL时仍能抑制90%细菌生长。

Thermal and pH Stability

LCFS在60-121°C热处理30-120分钟后仍保持100%抗菌活性，仅100°C处理120分钟后略有下降（99%），表明其抗菌成分具有高度热稳定性。在pH 2-4条件下活性完全保持，pH 5时降至95%，中性及碱性环境（pH 7-11）活性显著减弱（50-83%），说明酸性环境更有利于其抗菌作用。

Determination of Lactic Acid and Protein Content

LCFS中乳酸含量约20%（w/w），12.5 mg/mL和25 mg/mL LCFS中乳酸浓度分别为2.45 mg/mL和5.09 mg/mL；蛋白质含量仅0.15%（w/w）。经蛋白酶K处理后抑菌活性无显著变化（72% vs 71%，p>0.05），证实抗菌作用主要源于乳酸而非细菌素等蛋白类物质。

研究表明，基于糙米蛋白优化培养基发酵植物乳杆菌K014获得的LCFS具有强劲且稳定的抗痤疮丙酸杆菌活性，其主要活性成分为乳酸，对热和酸性环境高度稳定，且适合纯素配方。该成果不仅为痤治疗提供了天然、安全的新选择，也展示了植物基发酵在可持续护肤产品开发中的巨大潜力。未来研究需进一步开展体内实验及制剂开发，以推动其临床应用与产业化。