罗斯海表层与深海原核生物群落的水解酶指纹特征：基于宏基因组学的碳循环机制解析

本研究通过宏基因组学方法，系统解析了南极罗斯海不同水深原核生物群落的水解酶基因谱系，揭示了其针对颗粒有机碳（POC）降解的生态适应策略。表层群落酶谱受浮游植物动态显著影响，而深部微生物则表现出更复杂、多样的酶系统（如CAZymes、蛋白酶与脂肪酶），凸显其在碳输出与再矿化过程中的关键作用。

　　

1 引言

南大洋在全球二氧化碳吸收与碳储存中扮演关键角色，年吸收约1 Pg无机碳，占全球人为碳排放吸收量的40%。罗斯海作为高生物生产力区域，其浮游植物通过光合作用快速生成有机质，这部分有机质部分被原核生物和浮游动物消耗，部分以颗粒有机质（POM）形式输出至深海，维持深部食物网。这一垂直通量构成了生物碳泵的基本原理，而其效率与原核群落执行的再矿化过程密切相关——约70%的颗粒有机碳（POC）呼吸作用是由原核生物通过一系列水解酶协同完成的。

水解酶包括胞外酶和胞内酶，其中胞外酶负责催化大于600 Da、无法直接透过细胞膜的大分子物质的水解初步骤，胞内酶则进一步代谢水解产物以用于合成与分解代谢。胞外酶可进一步分为细胞结合型和溶解型，前者结合于细胞壁或周质空间，后者则通过主动分泌或被动释放进入环境。主要的水解酶类包括降解多糖的碳水化合物活性酶（CAZymes）、降解多肽的蛋白酶和降解脂类化合物的脂肪酶。

尽管罗斯海关键水解酶的活性已有较多研究，但其原核群落的遗传潜力仍待深入探索。宏基因组学等“组学”方法可为极地海洋环境中水解酶的功能多样性、分布及调控因素提供更深入和准确的认识。

2 方法

2.1 采样

研究基于2017年意大利第32次南极考察，在罗斯海沿陆架-外海梯度设置了4个站点（B、C1、C2、D），分别于表层（2 m）和深层（550–1065 m）采集水体样品。使用Niskin采水器获取水样，并分别处理“全水样”（whole seawater）和经1 μm滤膜预过滤的“自由生活群落”（free-living）样品，以考察不同生活方式（自由生活与颗粒附着）及不同营养状态对有机质降解基因组潜力的影响。

同时测定胞外酶活性，包括亮氨酸氨基肽酶（AMA）、β-葡萄糖苷酶（BGLU）和脂肪酶（OLEA）活性，使用荧光底物类似物（AMC和MUF衍生物）进行测定。颗粒有机碳（POC）和颗粒氮（PN）样品通过GF/F滤膜过滤，并使用元素分析仪测定。

2.2 浮游植物群落分析

500 mL（表层）和10 L（底层，浓缩为500 mL）水样用甲醛固定后，采用Uterm?hl方法在倒置光学显微镜下进行种类鉴定和计数，主要类群包括硅藻、甲藻和植鞭毛藻。

2.3 DNA提取与测序

使用DNeasy PowerWater Kit提取DNA，并通过Illumina MiSeq系统进行16S rRNA基因V4–V5区扩增子测序。宏基因组测序使用Nextera建库，在Illumina NextSeq 550平台上完成。所有数据已保存于NCBI SRA（登录号PRJNA609227）。

2.4 生物信息学分析

扩增子数据经QIIME2和DADA2处理，物种分类基于Silva 138.1数据库。宏基因组数据经质控和拼接后，使用PROKKA进行基因预测，并通过DIAMOND比对dbCAN、MEROPS和ESTHER数据库注释CAZymes、蛋白酶和脂肪酶。分泌酶信号肽预测使用SignalP 6.0。

2.5 统计分析

使用R语言进行多变量统计（ANOSIM、NMDS、CCA）、α/β多样性分析、以及组间差异检验（Wilcoxon检验），数据可视化主要基于ggplot2完成。

3 结果

3.1 环境背景

胞外酶活性沿水体垂直梯度普遍降低，表层最高酶活出现在站点C1（BGLU）和D（OLEA与AMA）。底层最高值均出现在C1。POC浓度表层平均为23.09±10.70 μmol C·L^?1，随深度显著降低，底层平均仅为0.78±0.29 μmol C·L^?1。POC/PN值随深度增加，表明深部有机质更富难降解性。

浮游植物群落组成站点间差异显著：站点B以南极棕囊藻（Phaeocystis antarctica）为主（90%），站点D和C2则以硅藻占优势（如伪菱形藻属Pseudo-nitzschia和脆杆藻属Fragilariopsis）。底层群落以甲藻和植鞭毛藻为主。

3.2 宏基因组分析和水解酶特征

共产生约3.77亿条原始读长，平均每个样本预测基因为198,709±87,522条，其中水解酶相关基因占40,201±24,347条。三大类水解酶中，蛋白酶基因丰度最高（22,753±10,004 rpm），其次为CAZymes（8,610±3,665 rpm）和脂肪酶（2,471±1,186 rpm）。

深度是造成酶基因组成差异的主要因素（ANOSIM: p < 0.05，R2 > 0.5）。整体水解酶基因丰度在表层与底层间无显著差异，但自由生活群落中其丰度随深度降低，而全群落（含颗粒附着菌）在深水中的基因丰度反而升高。

约50.7%的CAZymes家族、58.9%的蛋白酶家族和34.3%的脂肪酶家族被预测为分泌酶。深层样本的酶基因α多样性（Shannon指数）显著高于表层，尤其在脂肪酶和蛋白酶方面。针对复杂结构多糖（如木聚糖、阿拉伯聚糖、果胶等）的CAZymes家族在底层样本中数量更多、多样性更高。

3.3 DNA扩增子分析

微生物群落结构在表层与深层之间存在极显著差异（ANOSIM: p=0.0001, R2=0.94），而自由生活与全群落之间无显著区别。深度与微生物群落组成显著相关（CCA: R2=0.9679, p=0.003）。

4 讨论

研究表明，水深是塑造罗斯海原核生物群落结构和功能潜力的主要因素。深层样本酶谱组成较为均一，而表层样本受浮游植物空间异质性和有机质类型的影响更大，表现出更高的变异性。尤其颗粒附着微生物（如Polaribacter、Rhodobacteraceae和Saprospiraceae）贡献了表层水解酶基因的多数变异。

自由生活群落尽管物种组成差异大，但水解酶功能呈现一定冗余性，暗示生态系统功能的稳定性。而其分泌酶组的多样性更高，说明不同类群在分泌降解酶能力上存在生态位分化。

从生物地球化学角度看，表层微生物启动有机质的快速降解，消耗易降解组分，使沉降颗粒物变得越来越难降解。深水微生物则面临低浓度、高惰性的有机质环境，需依赖更丰富、更多样的酶系统以有效利用颗粒有机物。本研究证实，深水原核生物具有更富多样性的水解酶基因谱（尤其是蛋白酶与脂肪酶），更适应颗粒附着生活方式，并擅长降解复杂结构多糖（如藻类细胞壁成分）。

特别地，底层样本中富集了多种针对难降解多糖（如阿拉伯聚糖、果胶和木聚糖）的CAZymes家族（如GH142、PL10、CE19、CE7），凸显深部微生物在降解惰性有机质方面的代谢灵活性。蛋白酶基因在整体水解酶中丰度最高，反映了多肽作为重要氮源在罗斯海POM中的关键地位（占POM的40%–80%）。脂肪酶基因虽数量较低，但深部群落的脂肪酶多样性仍显著高于表层，表明其对脂类这一难降解、但具有显著下沉通量的有机组分的降解能力更强。

总之，罗斯海深部原核生物通过基因层面的适应，发展出更复杂、更多样的水解酶系统，尤其擅长降解沉降下来的复杂有机颗粒，从而在极端寡营养的深水环境中有效维持生命活动，并推动碳、氮等关键元素的地球化学循环。