农业沉积物微生物驱动的养分转化：DNA/RNA扩增子测序与宏转录组学揭示核心类群与代谢途径

本研究通过整合DNA与RNA扩增子测序及宏转录组学技术，深入解析农业影响下淡水沉积物微生物群落对氮（N）、磷（P）、硫（S）代谢的功能响应，揭示RNA测序在表征活性微生物功能方面的优势，为农业非点源污染治理提供微生物学依据。

　　

1 引言

农业养分径流是全球河流水质退化的主要原因，氮（N）、磷（P）等过量营养盐导致水体富营养化、缺氧及生态系统服务功能受损。微生物在沉积物养分循环中起核心作用，包括反硝化、硝酸盐异化还原为氨（DNRA）、硫氧化还原等过程。本研究通过多组学技术（DNA/RNA扩增子测序+宏转录组学）探究农业影响下沉积物微生物的分类与功能响应，重点关注N、P、S代谢途径。

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2 方法与材料

2.1 采样点设置

选取加拿大安大略省南部三个河流沉积物采样点：Big Creek（BC，无机肥主导）、Nissouri Creek（NC，粪肥混合）、Saugeen River（SR，低影响参考点），于2020年夏、秋两季采样，避免降雨干扰。

2.2 沉积物与水体采样

采集沉积物-水界面样品，液氮速冻；同步测定水体营养盐（NO₃^?、NH₄⁺、SRP、TP、SO₄^2?）及理化参数（温度、pH、溶解氧）。

2.3 DNA/RNA扩增子测序

共提取DNA/RNA，通过16S rRNA基因V5-V6区扩增，使用QIIME2流程处理数据，SILVA数据库进行物种注释，以CSS标准化和欧氏距离矩阵进行多样性分析。

2.4 宏转录组分析

RNA经rRNA去除后，进行Illumina NovaSeq测序，通过MG-RAST流程注释功能基因，聚焦N、P、S代谢的SEED子系统层级（L1-L4）。

2.5 统计分析

采用Mantel检验比较DNA/RNA分类群与功能基因相关性；LEfSe分析识别显著差异类群；DESeq2进行差异表达基因分析。

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3 结果

3.1 营养盐负荷

农业点（BC、NC）水体NO₃^?、TP、SRP、SO₄^2?浓度显著高于参考点SR，夏季普遍高于秋季。

3.2 微生物分类与功能关联

RNA分类群与N/P/S代谢功能显著相关（Mantel检验，r²=0.596, p=0.001），优于DNA数据（r²=0.288, p=0.011），表明RNA更适用于表征活性功能。

3.3 核心活性类群

基于RNA/DNA共现与LEfSe分析，BC以Aquabacterium、Thiobacillus、Sulfuritalea为主；NC以Flavobacterium、Dechloromonas为优势；SR以Sulfuritalea、Sideroxydans、Ferritrophicum为代表。秋季共享核心类数少于夏季，表明季节性功能分化。

3.4 功能基因表达差异

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  氮代谢：BC高表达DNRA相关基因（narH、napA）与硫氧化耦合；NC高表达羟胺还原酶（hao）和硝化应激基因；SR富集固氮（nif系列）和氨同化基因。
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  磷代谢：高亲和力磷酸盐转运蛋白（PstS）在BC夏季高表达；NC秋季上调PstA/C等转运基因；SR普遍高表达hppA（焦磷酸酶）。
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  硫代谢：BC富集硫氧化基因（SoxA、SoxB等）；NC以硫同化基因为主；SR呈现硫氧化与还原并存模式。

3.5 季节与空间差异

秋季功能基因差异较夏季更显著（BC vs. NC：36 vs. 16个差异基因），且农业点之间差异大于与参考点的差异。SR表现出最高的微生物多样性及功能周转弹性。

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4 讨论

4.1 RNA测序揭示活性功能关联

RNA分类群与代谢功能高度一致，支持其用于环境微生物活性功能研究的优势。

4.2 农业输入驱动功能分化

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  BC（无机肥）：DNRA与硫氧化耦合，伴随nosZ高表达，促进N₂O还原为N₂，可能助力硝酸盐去除。
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  NC（粪肥）：硝化应激显著，hao和Nitrosomonas富集，反映反应性氮积累；nosZ低表达暗示反硝化不完全。
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  SR（参考点）：固氮与氨同化基因活跃，硫氧化菌（Sulfuritalea）主导，多样性高预示生态韧性。

4.3 季节动态与生态启示

秋季降水增加可能通过输入外源微生物加剧功能分化，建议未来研究纳入多季节采样以全面评估养分循环。

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5 结论

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  RNA测序更有效揭示微生物活性功能；
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  农业点呈现施肥类型特异的微生物代谢模式（无机肥→DNRA+硫氧化；粪肥→硝化应激+磷积累）；
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  参考点固氮与多样性凸显生态健康；
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  季节变化显著影响功能基因表达，秋季分化加剧。
  该研究为农业流域微生物调控养分循环提供了多组学证据，支持RNA技术在环境微生物功能研究中的优先性。