Hesperetin通过CISD2依赖性机制调控细胞衰老与自噬缓解博来霉素诱导的肺纤维化

本研究揭示柑橘类黄酮Hesperetin通过靶向CISD2（CDGSH Iron–Sulfur Domain 2）调控Nrf2/HO-1信号通路，抑制氧化应激与细胞衰老，并恢复BECN1介导的自噬功能，从而显著改善博来霉素诱导的肺纤维化病理进程。该发现为肺纤维化防治提供了新型天然化合物干预策略。

　　

背景

肺纤维化是一种与年龄相关的慢性进行性间质性肺疾病，以肺功能不可逆下降和高死亡率为特征，诊断后中位生存期仅2-5年。该病病理特征包括异常细胞外基质（ECM）沉积、肺泡结构破坏、炎症反应募集和持续性成纤维细胞活化。细胞衰老作为关键致病机制，表现为不可逆细胞周期停滞、凋亡抵抗、衰老相关分泌表型（SASP）分泌和自噬功能受损。SASP组分如白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）通过旁分泌信号加剧多细胞生长停滞，诱导衰老肺泡上皮细胞（AECs）并削弱其损伤修复能力。

Hesperetin作为柑橘来源的类黄酮化合物，具有抗氧化和抗衰老特性，但其在肺纤维化中的作用尚未深入研究。CDGSH铁硫结构域2（CISD2）作为促长寿基因，定位于线粒体外膜和内质网（ER），在调控自噬、细胞衰老、凋亡和铁死亡中起核心作用。研究表明Hesperetin可通过上调CISD2增强线粒体功能并抑制炎症反应。

材料与方法

研究采用C57BL/6小鼠建立博来霉素诱导肺纤维化模型，通过气管内单次注射博来霉素（3 mg/kg）后口服Hesperetin（50 mg/kg/天）干预28天。体外实验使用人肺泡上皮细胞系A549，经腺病毒（AV）载体转染调控CISD2表达（过表达oeCISD2与沉默shCISD2）。通过组织染色（H&E、Masson）、免疫组化（IHC）、Western blot（WB）、qRT-PCR、SA-β-gal活性检测、ROS评估及分子对接等技术进行机制探索。生物信息学分析基于GEO数据库单细胞转录组数据集GSE227136和批量RNA数据集GSE132607。

结果

3.1 Hesperetin减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

博来霉素暴露导致小鼠体重增长减缓、肺系数显著升高（p< 0.05），肺组织结构破坏和Masson蓝染胶原沉积加剧。Hesperetin治疗显著改善肺泡结构完整性，降低炎症和纤维化程度（纤维化评分下降，p< 0.05）。血清中促纤维化SASP因子IL-1β和IL-6水平在博来霉素组显著升高，而Hesperetin干预有效逆转该趋势（p< 0.05）。WB和IHC结果显示，Hesperetin抑制了博来霉素引起的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达上调。

3.2 Hesperetin改善博来霉素诱导的肺组织细胞衰老

博来霉素暴露显著增加肺组织SA-β-gal阳性细胞比例（p< 0.05）及衰老标志物p21和CDK4表达。Hesperetin处理降低SA-β-gal阳性细胞率（p< 0.05），并下调p21和CDK4蛋白水平。ELISA检测证实Hesperetin逆转了博来霉素引发的IL-1β和IL-6升高，体现其抗炎与抗衰老作用。

3.3 Hesperetin通过激活Nrf2缓解细胞衰老与氧化应激

体外实验表明，40 μM博来霉素诱导A549细胞衰老（SA-β-gal阳性细胞增加，p< 0.05）并上调SASP因子。10 μM Hesperetin预处理显著提升细胞活力（CCK-8检测，p< 0.05），减少SA-β-gal阳性细胞，降低纤维化标志物（α-SMA、TGF-β1）和衰老标志物（p21、CDK4）表达。Hesperetin抑制博来霉素引发的ROS生成，激活核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游血红素氧合酶1（HO-1），恢复氧化应激平衡。

3.4 CISD2参与Hesperetin肺保护作用

分子对接显示Hesperetin与CISD2高亲和力结合（ΔG = ?15.66 kcal/mol）。体内外实验均证实博来霉素抑制CISD2表达，而Hesperetin干预逆转该效应。单细胞测序分析（GSE227136）显示CISD2在肺泡巨噬细胞、AT2细胞、单核细胞和NK细胞中差异表达。

3.5 CISD2过表达改善细胞衰老

CISD2过表达（oeCISD2）增强A549细胞活力，减轻博来霉素引起的SA-β-gal阳性细胞增加和SASP因子升高（p< 0.05）。WB显示oeCISD2下调α-SMA、TGF-β1、p21和CDK4表达，证实CISD2通过抑制细胞衰老缓解肺纤维化。

3.6 Hesperetin通过CISD2/BECN1通路恢复自噬功能

STRING数据库分析识别CISD2相关基因（BECN1、BCL2等），GSE132607数据集显示CISD2与BECN1显著正相关（R² = 0.5008, p< 0.05）。博来霉素下调BECN1、上调BCL2和p62（自噬抑制标志），提示自噬受损。Hesperetin处理逆转这些蛋白表达变化，表明其通过调控CISD2/BECN1通路恢复自噬功能。

3.7 CISD2沉默削弱Hesperetin保护效应

CISD2沉默（shCISD2）加剧博来霉素引起的细胞活力下降、SA-β-gal阳性细胞增加和SASP因子分泌。Hesperetin无法逆转shCISD2导致的细胞衰老、纤维化标志物上调和自噬相关蛋白（BECN1↓、p62↑、BCL2↑）异常表达，证明其作用依赖CISD2。

讨论

肺纤维化现有治疗手段（尼达尼布和吡非尼酮）仅能延缓疾病进展。本研究首次揭示Hesperetin通过靶向CISD2——一个调控线粒体功能与自噬的关键因子——发挥肺保护作用。CISD2表达随年龄增长下降，与细胞衰老和自噬功能障碍密切相关。Hesperetin通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路和CISD2/BECN1自噬通路，双重抑制氧化应激与细胞衰老。生物信息学分析证实CISD2与自噬启动因子BECN1在肺纤维化组织中正相关，机制上CISD2通过结合BCL2解除其对BECN1的抑制，从而促进自噬流。

研究局限性包括：Hesperetin在 established 肺纤维化中的治疗效价需进一步评估；CISD2与BECN1互作机制有待深入解析；除AT2细胞外，其他细胞类型（如免疫与间充质细胞）中CISD2的作用仍需探索。

结论

Hesperetin通过CISD2依赖性机制激活Nrf2信号、抑制氧化应激与细胞衰老，并恢复BECN1介导的自噬功能，从而有效缓解博来霉素诱导的肺纤维化。该天然化合物为肺纤维化防治提供了新颖的治疗策略。

作者贡献与伦理声明

研究设计由Chaofeng Zhang和Qi Lin完成；实验由Qi Lin、Wenjie Fan、Ziyi Chen和Bin Chen执行；数据分析由Wenjie Fan和Ziyi Chen完成；稿件撰写由Wenjie Fan和Qi Lin完成。动物实验遵循ARRIVE 2.0指南，经莆田学院附属医院伦理委员会批准（ID: 2025DW070）。作者声明无利益冲突。