CDT1过表达通过结合MCM复合体抑制S期复制叉进展并诱导DNA损伤的机制研究

本综述深入探讨了CDT1（Cdc10-dependent transcript 1）在DNA复制许可中的核心作用及其过表达引发的病理效应。文章揭示了CDT1通过与微型染色体维持复合物（MCM）相互作用，直接抑制复制叉进展（独立于其许可活性），导致S期阻滞并诱发DNA双链断裂（DSB）。该研究为理解肿瘤细胞中基因组不稳定的机制提供了关键分子基础，对癌症治疗靶点开发具有重要启示意义。

　　

CDT1抑制复制叉进展的机制不依赖于其许可活性

为了阐明CDT1抑制复制叉进展的分子机制，研究团队构建了可在人MCF-7细胞中诱导表达野生型CDT1（CDT1-WT）及其突变体的细胞系。关键突变体CDT1-NDL通过替换精氨酸210为丙氨酸（破坏PIP-box、Cy-motif和D-box）并融合SV40 T抗原核定位信号（NLS），成为具有减弱许可活性的不可降解突变体。实验表明，CDT1-NDL的表达导致细胞周期在S期停滞，而不会引起显著的重复复制。进一步构建的不能结合geminin的突变体CDT1-NGB-NDL（缺失150-170氨基酸区域）更明显地减少了EdU掺入，证实CDT1抑制复制叉进展的能力独立于其引发重复复制的许可活性。

与MCM复合体相互作用的能力是CDT1抑制复制叉进展所必需的

研究表明，CDT1通过其C端结构域与Mcm6直接结合。当CDT1-NGB-NDL中参与该相互作用的氨基酸（精氨酸425、异亮氨酸426和赖氨酸429）被突变为丙氨酸（获得弱MCM结合突变体CDT1-NGB-WMB）后，其与Mcm6的亲和力降低，并且失去了抑制细胞周期进展的能力。这证明CDT1与MCM复合体的相互作用是其抑制复制叉功能的关键。

CDT1的中段区域对抑制复制叉进展至关重要

CDT1蛋白包含三个功能区域：N端、中段和C端。中段和C端各含有一个翼状螺旋结构域（WHD）。实验发现，仅表达包含中段和C端的片段（CDT1-MC）能够抑制细胞周期，而仅表达C端片段（CDT1-C）则无效。GST pull-down实验证实CDT1-MC能与Mcm6有效结合，而CDT1-C不能。此外，在中段WHD的两个β折叠片（S1和S2）中引入丙氨酸突变（获得CDT1-NGB-S1S2）后，虽然其与Mcm6的结合能力未受影响，但却丧失了抑制细胞周期的能力。这表明中段WHD的结构（可能通过介导CDT1自我关联或其它未知功能）与C端的MCM结合域共同作用，对于有效抑制复制叉进展缺一不可。

缺乏抑制DNA复制能力的CDT1突变体表现出对染色质的亲和力降低

细胞分级实验显示，能有效抑制S期进展的CDT1-NGB-NDL几乎完全存在于染色质组分中。而不能抑制细胞周期的突变体CDT1-NGB-WMB和CDT1-NGB-S1S2则在可溶性和染色质组分中均有分布。这种差异并非源于DNA结合能力的变化，因为突变体与双链或单链DNA的结合亲和力与野生型无异。这表明CDT1-NGB-NDL是通过与染色质上的蛋白质（如MCM复合体）结合，而非直接结合DNA，来发挥其抑制功能的。即使在用aphidicolin将细胞阻滞在S期后，上述现象依然存在，说明CDT1抑制复制叉需要其有效结合到复制叉处的染色质上。

外源CDT1表达诱导的基因组不稳定性并非源于重复复制

CDT1-NGB-NDL的过表达强烈抑制了细胞增殖。分子分析发现，复制应激感应激酶ATR在其Thr¹⁹⁸⁹位点发生自磷酸化并被激活，其下游效应激酶CHK1也发生磷酸化（Ser³¹⁷），表明ATR-CHK1检查点通路被激活。同时，DNA双链断裂（DSB）标志物γH2AX的水平升高。此外，参与同源重组（HR）修复的蛋白（MRE11、RAD51和RPA2）在染色质组分中积累。这些结果综合表明，CDT1介导的复制叉停滞最终会导致复制叉坍塌并形成DSB，进而激活同源重组修复通路。因此，CDT1过表达不仅可通过诱发重复复制，还能通过直接导致复制叉停滞和断裂来诱导基因组不稳定性。

讨论

本研究揭示了CDT1过表达抑制DNA复制的新机制，该机制独立于其经典的复制许可功能。核心发现在于，CDT1通过其C端结构域与MCM复合体（尤其是Mcm6）相互作用，并依赖其中段翼状螺旋结构域（WHD）的完整性，直接抑制了CMG解旋酶的进展，从而导致复制叉停滞。这种停滞会引发复制应激，激活ATR-CHK1检查点信号通路，并最终导致复制叉坍塌、DNA双链断裂（DSB）的形成以及同源重组修复机制的激活。

许多肿瘤细胞中存在CDT1的过表达，这与预后不良密切相关。本研究阐明的机制表明，CDT1的异常高表达不仅是基因组不稳定的结果，更可能是其驱动因素。它通过诱导重复复制和直接阻碍复制叉进展两种方式，成为复制应激和基因组不稳定的重要来源。这为理解肿瘤发生和发展提供了新的分子视角，并提示CDT1及其相关通路可能成为癌症治疗中一个有潜力的干预靶点。