HSP70调控人原代内皮细胞通透性与机械转导的分子机制及其在血管稳态中的作用

本研究发现HSP70（70 kDa热休克蛋白）作为关键分子伴侣，直接与血管内皮细胞连接蛋白PECAM-1/CD31和VE-cadherin相互作用，调控内皮屏障完整性和机械转导功能。研究揭示HSP70功能缺失会导致细胞连接解离、通透性增加和eNOS表达下调，为心血管疾病（如高血压、中风）和肺部疾病的治疗提供了新靶点。

　　

Abstract

血管屏障破坏是心血管疾病、中风、高血压、肺部疾病、感染和癌症等疾病的典型特征。内皮细胞通透性受剪切应力严格调控，生理性层流可维持组织灌注，而紊乱血流会导致通透性增加。细胞间连接蛋白包括血小板/内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1/CD31）和VE-cadherin，在机械转导和屏障完整性中起重要作用。70 kDa热休克蛋白HSP70在心血管生理中具有明确的细胞保护功能。本研究假设HSP70与这些连接蛋白相互作用并调控其功能。

研究方法与结果

细胞培养与处理

研究采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC），使用Lonza的EBM-2培养基培养。通过锥板系统施加15 dynes/cm²的层流剪切应力，采用HSP70抑制剂VER-155008（50 μM）和YM-1（20 μM）进行化学抑制。

分子相互作用验证

免疫共沉淀实验证实内源性HSP70与PECAM-1和VE-cadherin存在直接结合。邻近连接 assay（PLA）在内皮单层中显示阳性信号。序列分析发现PECAM-1和VE-cadherin存在多个潜在的HSP70结合位点，基于DnaK底物识别模式。

功能表型分析

HSP70功能缺失导致VE-cadherin和PECAM-1在细胞表面的解离，并选择性降低PECAM-1的稳态表达。同时，HSP70抑制降低内皮型一氧化氮合酶（eNOS）水平。透性实验表明，HSP70抑制剂显著增加HUVEC和HCAEC单层的旁细胞通量。

机械转导与细胞排列

在生理层流剪切应力下，HSP70对于促进HUVEC的自然细胞排列至关重要。抑制HSP70后，静脉内皮细胞失去流动诱导的细胞定向排列能力，而动脉内皮细胞的影响较小。

细胞周期与增殖

EdU掺入实验显示，VER-155008处理抑制DNA合成，而YM-1处理增加EdU掺入，表明HSP70调控内皮细胞周期进程。

血栓调节蛋白运输

HSP70抑制阻碍血栓调节蛋白（TM）从内质网到高尔基体的运输，热休克条件下也观察到类似模式。细胞表面血栓调节蛋白分布未受影响。

讨论与意义

本研究首次发现HSP70与VE-cadherin和PECAM-1的直接相互作用，揭示了HSP70通过调控内皮连接蛋白稳定性来维持血管屏障功能和机械转导的新机制。这些发现为治疗血管高通透性疾病（如哮喘、缺血性中风和感染）提供了新思路，增强HSP70分子伴侣功能可能成为恢复血管完整性的治疗策略。

研究还表明HSP70在动脉和静脉内皮细胞中具有部分差异性的功能表现，提示血管床特异性调控机制。未来研究需要明确HSP70与连接蛋白结合的具体位点，并开发特异性调控策略用于心血管疾病治疗。