THPO在胃癌淋巴结转移中的作用及分子机制：基于TCGA数据的生物信息学分析与实验验证

本文通过整合TCGA数据分析与体外实验验证，系统阐明了THPO在胃癌淋巴结转移中的关键作用。研究发现THPO表达与晚期N分期（N3）显著相关，并通过促进上皮间质转化（EMT）和调节免疫微环境（特别是M2巨噬细胞浸润）驱动肿瘤进展。基于THPO构建的预后模型对1/3/5年生存率表现出优异预测能力（AUC>0.80），实验证实敲低THPO可抑制胃癌细胞迁移并阻断EMT通路，表明其作为胃癌治疗靶点与预后标志物的临床潜力。

　　

1. 引言

胃癌是全球重大健康负担，在恶性肿瘤中发病率位居前列，其癌症相关死亡率高达第二至第三位。早期胃癌局限于黏膜或黏膜下层时预后良好，5年生存率可达90%，但一旦发生转移，生存率骤降至10%（转移性疾病）和20%-40%（局部晚期伴区域转移）。近年来公共卫生倡议、人群筛查项目和内镜成像技术的进步显著提高了早期胃癌的检出率。内镜黏膜下剥离术（ESD）和内镜黏膜切除术（EMR）等微创干预措施的实施改善了治疗效果，降低了围手术期发病率、医疗支出，并提升了生活质量指标。然而，这些术后隐匿性淋巴结转移（LN metastasis）的持续风险仍是关键临床问题，因其对长期预后产生深远影响。

国际癌症控制联盟（UICC）强调TNM分期（特别是LN分类）是经过验证的预后决定因素。隐匿性LN转移是术后复发和远处播散的重要风险因素，局部切除后局部复发率（15%-25%）和全身复发率（30%-45%）的证据支持了这一观点。已建立的临床病理预测因子包括肿瘤分化等级、大小、切除边缘状态和淋巴血管侵犯，可指导临床管理。然而，早期胃癌LN转移的分子机制仍不清楚。这一知识空白凸显了机制研究的迫切性，以优化内镜切除后的手术决策和辅助策略。

2. 方法

2.1. 数据获取与患者选择

从TCGA通过GDC数据门户检索胃腺癌（STAD）的临床元数据和RNA测序（RNA-seq）谱。原始计数和相应的临床记录经过协调和严格质量控制：排除LN分期信息不完整、RNA-seq数据缺失或组织学不明确的样本。使用修剪均值M值（TMM）方法对基因水平计数进行标准化，并进行log2转换用于下游分析。根据美国癌症联合委员会（AJCC）分期手册第八版，将患者分为病理N类别（N0、N1、N2和N3）。为最大化无转移和广泛播散之间的生物学对比，聚焦两个极端：N0（n=124，无LN转移）和N3（n=82，≥7个阳性LN）。这一严格选择方案最小化了中间异质性，并突出了胃癌进展性LN转移的分子特征。

2.2. 差异表达分析

使用DESeq2 R包进行N0和N3期胃癌组织之间的差异基因表达分析。绝对log倍数变化（|logFC|）大于0.5且p值小于0.05的基因被视为显著差异表达基因（DEGs）。

2.3. 蛋白质-蛋白质相互作用网络

使用STRING数据库构建已识别DEGs的PPI网络。仅包含置信度评分高于0.4的相互作用。使用Cytoscape软件进行网络可视化。

2.4. 生存分析

采用单变量Cox比例风险回归分析评估每个DEG对生存的影响。将识别为风险或保护因素的基因纳入进一步分析。生成Kaplan-Meier（KM）生存曲线以评估THPO表达对总生存期（OS）、无病生存期（DFS）和无进展生存期（PFS）的影响，并使用对数秩检验确定统计学显著性。

2.5. GSEA

使用分子特征数据库（MSigDB）中的Hallmark基因集进行GSEA，以识别THPO高表达与低表达患者之间富集的生物学通路。计算标准化富集分数和名义p值以评估通路激活。

2.6. 免疫微环境分析

使用Xcell、TIMER、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、EPIC和CIBERSORT算法量化免疫微环境的组成。使用Spearman相关系数确定THPO表达与不同免疫细胞类型丰度之间的相关性。

2.7. 基因组特征分析

使用Spearman相关分析评估THPO表达与基因组特征（如肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）和基于mRNA的干性指数（mRNAsi和EREG-mRNAsi）之间的相关性。分析突变数据以比较高和低THPO表达患者关键基因的突变频率。

2.8. 预后模型构建

使用与生存显著相关的变量开发预后模型。采用LASSO回归从THPO相关分子中选择最相关的预后变量。然后使用多变量Cox回归模型构建最终预后模型，并推导风险评分公式。绘制受试者工作特征（ROC）曲线以评估模型对1年、3年和5年生存的预测准确性。

2.9. 细胞培养与siRNA转染

人STAD MKN-45细胞在RPMI-1640培养基（补充10%胎牛血清（FBS；Gibco）和1%青霉素-链霉素（Gibco）中维持，于37°C、5% CO₂湿润气氛中培养。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）每2-3天常规传代以维持对数生长。将MKN-45细胞（3×10⁵每孔）接种到6孔板中，培养过夜以达到70%-80%汇合度。将靶向人THPO的siRNA或非靶向对照siRNA制备为125 nM，并按照制造商方案使用lipo2000转染试剂递送。6小时后，更换为完全RPMI-1640培养基，并在功能测定前再培养48小时。通过定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹确认基因沉默（>70%）。

2.10. qRT-PCR

使用TRIzol提取总RNA，通过NanoDrop定量，并使用商业cDNA试剂盒进行逆转录。在CFX96系统上使用SYBR Green进行三重qPCR。将THPO mRNA水平标准化为GAPDH，并通过2^(-ΔΔCt)方法计算。

2.11. 蛋白质印迹

在补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1:100）的RIPA缓冲液中裂解细胞。等量上样于10% SDS-PAGE，转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭，并在4°C下与抗THPO（1:1000）和抗GAPDH（1:5000）抗体孵育过夜。与HRP偶联二抗孵育（1:5000，1小时）后，使用ECL试剂显影条带。

2.12. 统计分析

所有统计分析均使用R软件（4.0或更高版本）进行。除非另有说明，所有分析中p值小于0.05视为具有统计学显著性。

3. 结果

3.1. 识别与胃癌LN转移相关的分子

首先，来自TCGA的临床信息使我们能够将胃癌患者分为N0、N1、N2和N3期。为精确定位与LN转移相关的分子，我们分析了N0（124例）和N3（82例）期患者的DEGs，显著截断值为|logFC|>0.5且p值<0.05。这些DEGs的PPI网络显示。单变量Cox分析识别出多个DEGs，如ABCA6、DCLK1和ADCYAP1作为风险因素，而TMEM211具有保护作用。此外，我们评估了这些分子在正常和胃癌组织中的表达差异。发现DCLK1和ADCYAP1等分子下调，而THPO和C5orf46在胃癌中上调。然而，我们发现C5orf46在N3患者中下调，因此选择THPO进行进一步分析。

3.2. THPO在胃癌中的临床作用

THPO在胃癌中上调，与晚期N分期相关。较高的THPO表达与较差的生存结果相关，如KM生存曲线所示。同时，我们发现THPO与晚期T分期、临床分期和组织学分级相关。

3.3. THPO在胃癌中的生物学富集

GSEA分析显示，在THPO高表达患者中，Notch、TGF-β和两种干扰素反应等通路上调，表明其在EMT中的作用，这是肿瘤转移的关键过程。此外，THPO与CDH1和VIM呈负相关，与CDH2和FN1呈正相关，支持其在EMT中的作用。

3.4. THPO在胃癌免疫微环境中的作用

使用多种算法评估了对肿瘤进展至关重要的免疫微环境。THPO与M2巨噬细胞、内皮细胞和单核细胞的存在呈正相关。

3.5. THPO在胃癌中的基因组特征

我们还探讨了THPO与基因组特征的关系。THPO与肿瘤干性指数—mRNAsi和EREG-mRNAsi呈负相关。然而，与TMB和MSI评分无显著相关性。突变差异分析显示，在THPO低表达患者中，MUC16和PCLO的突变更高。

3.6. 基于THPO相关分子的预后模型构建

通过相关分析，识别出显著的THPO相关分子。单变量Cox分析和LASSO回归帮助细化预后变量，导致涉及ZNF22、GPC3、FKBP10和SLCO4A1的多变量Cox回归模型。开发的风险评分公式为“风险评分=SLCO4A1??0.117+FKBP10?0.092+GPC3?0.061+ZNF22?0.361”。分类为高风险类别的患者表现出更高的死亡率。KM和ROC曲线证明该模型有效预测胃癌患者的1年、3年和5年生存率。

3.7. THPO促进胃癌细胞迁移能力和EMT通路

随后，我们研究了THPO在胃癌细胞系MKN-45中的生物学作用。首先，使用siRNA瞬时敲低THPO，并通过蛋白质印迹验证效率。随后，使用transwell实验检测敲低THPO后胃癌细胞迁移能力的变化。结果显示，敲低THPO显著降低了MKN-45细胞的迁移能力。我们的GSEA结果表明THPO与EMT通路呈正相关。为此，我们检测了敲低THPO是否会影响EMT通路相关指标。正如预期，敲低THPO显著降低了EMT通路的活性。

4. 讨论

早期胃肿瘤通常比晚期疾病表现出较低的LN转移发生率，归因于其较小的肿瘤负荷、较高的分化程度以及减少的神经或血管侵犯。胃病变的内镜切除主要适用于无LN转移证据的早期癌症或癌前病变。目前内镜切除前淋巴结状态的临床评估严重依赖成像方式，如增强CT、MRI和内镜超声。虽然这些技术为评估淋巴结 involvement提供了明显优势，但其诊断准确性受到包括炎症性淋巴结病和检测早期转移沉积物困难等挑战的限制。关键的是，用于预测早期胃癌LN转移的经过验证的分子生物标志物仍然难以捉摸。阐明早期疾病中淋巴播散的分子机制对于完善预后分层和实现个性化患者管理策略具有重要前景。

在我们的研究中，我们使用TCGA的临床信息将胃癌患者分为N0、N1、N2和N3期，并通过比较N0和N3期患者的基因表达来识别与LN转移相关的关键分子。我们发现ABCA6、DCLK1和ADCYAP1等分子与较高风险相关，其中DCLK1和ADCYAP1下调，而THPO和C5orf46在胃癌组织中上调。值得注意的是，THPO表达升高与晚期N分期相关，并与较差的生存结果（包括降低的OS、DFS和PFS）相关。GSEA进一步揭示THPO在促进EMT的通路中起关键作用，这是肿瘤转移的关键过程。免疫微环境分析显示THPO与M2巨噬细胞、内皮细胞和单核细胞的存在呈正相关。基于THPO和相关分子构建的预后模型有效预测了胃癌患者的1年、3年和5年生存率。此外，在MKN-45细胞中敲低THPO抑制了迁移并阻断了EMT通路，证实了其在胃癌中的促转移作用。这些发现不仅突出了THPO在胃癌进展中的重要作用，还为未来治疗提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。

THPO主要以其在造血中的作用而闻名，特别是在刺激骨髓中巨核细胞产生和成熟为血小板方面。然而，最近的研究扩展了我们对THPO功能的理解，表明其参与各种恶性肿瘤。在胃癌中，我们发现THPO在肿瘤组织中上调，与晚期疾病阶段和较差的预后结果相关。这种关联表明THPO可能通过调节细胞机制（如细胞增殖、凋亡和迁移）影响肿瘤生长和转移。THPO在癌症背景下的研究提供了一个引人注目的例子，说明已知在正常生理过程中作用的分子可能在肿瘤发生和癌症进展中具有关键意义。

GSEA揭示THPO参与激活癌症病理生理学中几个关键信号通路， notably Notch和TGF-β通路，以及与干扰素反应相关的通路。这些通路对于EMT过程至关重要，这是癌症转移的关键机制。EMT赋予癌细胞从原发性肿瘤块解离、侵袭周围组织并建立继发性肿瘤的能力，从而促进转移。THPO的上调及其与这些通路的关联表明它可能是促进EMT和肿瘤进展的复杂信号网络中的调节因子。理解这些相互作用可以深入了解胃癌的分子基础，并为靶向治疗开辟潜在途径。

THPO与肿瘤免疫微环境之间的相互作用，特别是其与M2巨噬细胞的关联，突出了其在癌症生物学中作用的一个关键方面。M2巨噬细胞，通常称为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），以其促肿瘤活性而闻名，包括支持肿瘤生长、促进血管生成和抑制抗肿瘤免疫。THPO与胃癌中M2巨噬细胞的正相关表明它可能影响这些细胞的招募或分化，从而有助于有利于肿瘤进展的免疫抑制微环境。这种关系突出了THPO在促进肿瘤发生通路和调节免疫景观方面的双重作用，使其成为旨在改变对胃癌免疫反应的疗法的潜在有价值靶点。

虽然我们的研究强调了THPO在胃癌进展中的重要作用及其与不良预后的关联，但必须承认几个局限性。首先，整个分析基于TCGA的回顾性数据，可能存在选择、收集和注释偏差。其次，尽管我们观察到THPO表达与M2样巨噬细胞浸润之间的相关性，但THPO对肿瘤微环境的直接免疫调节效应需要通过 dedicated功能测定进行机制验证。第三，也是最重要的，基于THPO相关分子构建的预后模型目前缺乏内部和外部临床验证。因此，在 any临床应用之前，前瞻性、多中心研究对于确认模型的准确性和普适性至关重要。