健康老年人外周血单核细胞线粒体呼吸作用与免疫、体能及代谢风险的关联研究

本研究通过横断面分析揭示，健康老年个体PBMCs线粒体功能（MRPBMC）与CD4+ T细胞亚群分布、炎症因子（如TNF-α、IL-17）及代谢指标（如血糖、HbA1c）显著相关，提示线粒体能量代谢在免疫衰老和代谢调节中的核心作用，为促进健康老龄化提供潜在生物标志物和干预靶点。

　　

1 引言

衰老伴随生物学功能逐渐衰退，涉及代谢改变、系统性炎症增加和免疫力下降。线粒体作为细胞能量代谢中枢，其功能障碍被认为是代谢性和免疫性衰老的关键因素。线粒体呼吸能力，尤其是基础呼吸（basal respiration）和最大呼吸（maximal respiration），直接反映细胞能量生成效率，是代谢健康的重要指标。在免疫细胞中，线粒体功能调控T细胞活化、分化和功能状态，例如初始T细胞（na?ve T cells）依赖氧化磷酸化（OXPHOS），而效应记忆T细胞（effector memory T cells）则更倾向于糖酵解。

衰老细胞中线粒体结构改变，包括体积增大、线粒体自噬（mitophagy）受损、NAD⁺/NADH失衡、Ca²⁺超载和mtDNA突变，导致呼吸功能下降和膜电位降低。这些变化影响免疫细胞的六大代谢通路：糖酵解、三羧酸循环（TCA cycle）、氨基酸代谢、戊糖磷酸途径、脂肪酸氧化（FAO）和脂肪酸合成。

近期研究发现，PBMCs（包括单核细胞、树突状细胞和淋巴细胞）的线粒体呼吸能力与疾病严重程度呈负相关，例如肺动脉高压和心血管代谢风险因素。相反，健康生活方式（如营养饮食和规律运动）可能延缓衰老进程，改善免疫细胞线粒体功能。然而，PBMCs线粒体功能是否反映骨骼肌线粒体功能尚存争议，仅在特定临床人群（如线粒体疾病患者）中可能作为替代标志物。

本研究旨在探讨健康老年人PBMCs线粒体呼吸与免疫功能、系统性炎症和代谢健康标志物的关联，通过横断面设计捕捉稳态条件下的个体差异，为未来纵向或干预研究提供假设基础。

2 材料与方法

2.1 研究设计与参与者

本研究纳入16名健康、体力活跃的老年人（男性9人，女性7人；平均年龄64±3.7岁；BMI 24.3±2.9；VO_2peak 31.1±8.8 mL/min/kg），均为吉森免疫衰老研究队列的子集。入选标准包括年龄>55岁、绝经后女性、无心血管、神经、代谢或系统性疾病史，未使用免疫调节药物。所有参与者签署知情同意书，研究经伦理委员会批准（AZ 100/20）。空腹静脉血样本在上午8:00–10:00采集，用于血清分离和PBMCs分离。体成分通过生物电阻抗分析（BIA）评估，心肺运动测试采用个体化斜坡协议，握力通过液压手 dynamometer 测量。

2.2 PBMCs分离与线粒体呼吸测量

PBMCs通过密度梯度离心法分离，使用SepMate管和EasySep试剂，细胞冻存于含10% DMSO的Bambanker培养基，-80°C保存约6个月。解冻后细胞活力≥85%者用于高分辨率呼吸测量（Oroboros O2k-Oxygraph），采用底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）协议，测量基础呼吸、LEAK呼吸（寡霉素抑制ATP合酶后）和最大呼吸（FCCP逐步滴定）。耦合效率通过L/E和(E-L)/E比值评估。

2.3 T细胞表型分析

流式细胞术分析T细胞亚群：使用抗体标记CD3、CD4、CD25、CD45RO、CCR7、CD127等。调节性T细胞（T_regs）定义为CD4⁺CD25⁺CD127_low，效应T细胞（T_eff）为CD4⁺CD25⁺CD127_high。初始和记忆亚群通过CD45RA和CCR7表达区分。

2.4 血清细胞因子与信号分子检测

血清细胞因子（如TNF-α、IL-8、VEGF、ICAM-1等）通过LUMINEX assays测量。RNA提取后，qPCR分析STAT3、LMB1、FOXO3、TP53表达，以CANX、MDH1、SDHA为内参基因。

2.5 统计分析

采用单变量线性回归分析MR_PBMC与各变量的关联，计算回归系数（?）和95%置信区间（CI），显著性设定为p<0.05。探索性多变量回归调整年龄、体脂百分比和VO_2peak，以评估关联稳定性。

3 结果

3.1 MR_PBMC与PBMCs亚群的关联

基础MR_PBMC与CD4⁺ T细胞比例正相关（?=0.093, p<0.05），最大MR_PBMC与CD4⁺、CD8⁺、初始CD4⁺ T细胞正相关，但与效应记忆CD4⁺ T细胞负相关（?=?0.170, p<0.05）。未发现与T_regs、T_eff或其他记忆亚群的显著关联。

3.2 MR_PBMC与血浆细胞因子及信号分子的关联

基础MR_PBMC与IL-17（?=?0.879, p<0.05）和TNF-α（?=?0.730, p<0.05）负相关，与肌红蛋白正相关（?=0.546, p<0.05）。最大MR_PBMC与IL-8（?=0.495, p<0.05）、ICAM-1（?=0.000026, p<0.05）和VEGF（?=0.027, p<0.05）正相关。STAT3表达与最大MR_PBMC正相关（?=5.910, p<0.01）。

3.3 MR_PBMC与代谢及体能参数的关联

基础MR_PBMC与年龄（?=0.260, p<0.05）和血糖（?=0.104, p<0.05）正相关。最大MR_PBMC与血糖正相关（?=0.194, p<0.05），但与HbA1c负相关（?=?5.777, p<0.05）。未发现与BMI、体脂、VO_2peak或握力的关联。

3.4 多变量回归分析

调整年龄、体脂和VO_2peak后，CD4⁺ T细胞和年龄仍与基础MR_PBMC独立相关（调整R2=0.436）。TNF-α和年龄联合解释基础MR_PBMC变异的45%（p=0.004）。STAT3是最大MR_PBMC的最强预测因子（调整R2=0.495, p<0.05）。

4 讨论

本研究显示，PBMCs线粒体呼吸与CD4⁺ T细胞亚群分布、炎症状态和代谢健康密切相关。较高的线粒体呼吸能力关联更多初始CD4⁺ T细胞，提示更好的免疫适应性；而较低呼吸能力关联效应记忆细胞和促炎状态（如高TNF-α、IL-17）。这些发现强调线粒体功能在免疫代谢调节中的核心作用。

STAT3信号通路与最大呼吸能力正相关，可能通过转录调控或线粒体直接作用增强能量代谢。VEGF和IL-8的关联反映线粒体功能可能支持血管生成和炎症反应的能量需求。代谢方面，血糖与MR_PBMC正相关，而HbA1c负相关，提示糖代谢紊乱可能损害线粒体功能。

值得注意的是，本研究未发现MR_PBMC与心肺健康（VO_2peak）的关联，可能源于人群同质性。结果支持线粒体功能作为健康老龄化的潜在标志物，但需更大样本和纵向研究验证。

5 结论

PBMCs线粒体呼吸与免疫细胞分布、炎症水平和代谢指标显著相关，提示线粒体生物能量学是健康衰老的关键调节因子。未来研究应探索通过生活方式干预改善线粒体功能，促进免疫代谢健康。