大麻（Cannabis sativa）农艺性状变异的遗传与环境贡献及其对花序结构与产量调控的机制研究

本研究系统评估了20种不同化学型大麻在两种商业环境下的农艺性状变异，通过创新的图像分割表型分析方法量化了花序紧实度及“狐尾化”（foxtailing）现象。研究发现基因型（G）、环境（E）及其交互作用（G×E）共同调控关键性状，其中营养性状遗传力较高（如株高H2>0.8），而花序性状更易受环境影响。该研究为定向育种和栽培优化提供了可操作的见解，对提升大麻产量与品质标准化具有重要实践意义。

　　

引言

随着全球药用大麻（Cannabis sativa L.）产业的建立，优化花序性状（包括 uniformity、品质和产量）成为关键生产目标。大麻通过其地上器官尤其是成熟雌花序中高密度的腺毛 trichome 积累大量 cannabinoid 类特殊代谢物。这些形态和生化性状的变异主要源于遗传（genetics）、环境（environment）及二者互作（genotype-by-environment interactions）。药物型大麻品种可积累 Δ⁹-tetrahydrocannabinol（Δ⁹-THC）等 cannabinoid，而纤维型则不能。近年来，加拿大和美国等地对医用及娱乐用大麻的合法化导致了对特定 cannabinoid 浓度种质的需求增加。

Cannabinoid 在生殖生长阶段积累浓度最高，营养生长向生殖生长的转变使茎尖分生组织 transition 为花分生组织，产生花序而非叶片，并改变叶形态（减小叶 size、petiole length 和 lobe number）。花序结构为复合总状花序（compound raceme），其紧实度（compactness）与产量增强直接相关。然而，大麻农艺性状在群体内和群体间高度变异，这种变异源于基因型与环境的互作（G×E）。深入了解花序结构发育将有助于旨在提高产量的育种计划。

花形态影响植物的感官价值（organoleptic value），而标准化质量评估矩阵对药用目的至关重要。花序质量基于 size、compactness 和生化特性等因素评估。形态特征（如花序密度和产量）表现出与地理起源相关的显著变异：来自干旱高海拔地区的植物往往形成更紧凑的花序（以适应 conserve moisture 和保护 reproductive structures），而热带或亚热带起源的植物花序较松散（以促进 airflow 和减少真菌感染风险）。一种称为“狐尾化”（foxtailing）的表型——在成熟后期出现 indeterminate flowering，导致 elongated calyce 和松散花序——常导致品质不一致。

最大化大麻产量和紧实度取决于环境条件、品种（遗传组成）及基因型与环境的互作（G×E）。园艺实践（如修剪、使用 phytohormone 或改变光强度和光谱以引发激素响应）被用于增加花卉生物量。例如，调节分枝程度导致节间收缩（internode contraction）可能使花序簇更紧实和大，从而增加总产量。

鉴于花序紧实度对产量和品质的重要性，建立表型分析方法以准确测量大麻花序紧实度并理解环境变异对花序形态的影响至关重要。本研究旨在表征与花序紧实度相关的农艺性状，首先建立使用图像分割准确测量紧实度的技术，其次研究遗传（品种类型）和环境对性状变异的贡献。

材料与方法

种质与生长条件

20个雌性大麻无性系品种（来自不同品系，具有多样化 phytochemical profile）被用于试验。植物从每个品种的 established mother plant 无性繁殖。两个试验在两个不同生长季节（夏季）进行，地点为南非斯坦陵布什（Stellenbosch），每个试验使用相同品种的七个重复。管理实践保持一致：每天浇水两次，肥料为氮:磷:钾（营养阶段 3:1:2；生殖阶段 1:3:2），土壤成分为 potting soil:perlite:coir（2:1:1）在5升袋中。第一个试验（E1）在高度自动化的商业温室中进行（2021年8月至12月），第二个试验（E2）在常规半控制温室中进行（2021年11月至2022年4月）。两个试验的生长条件差异包括 daily temperature（E1:25–28°C；E2:30–45°C）、light source（E1:补充光照，光合光子通量密度 250–400 μmol m^?2 s^?1；E2:自然光无补充）、光周期和种植密度（E1:16 plants m^?2；E2:10 plants m^?2）。

遗传关系分析

DNA从约70 mg叶片材料中提取，使用 sbeadex magnetic beads kit。全基因组 single nucleotide polymorphism（SNP）基于专有大麻泛基因组组装鉴定。Genotyping 在 exon region 的5564个SNP位点进行，使用 AgriSeq Targeted Genotyping by sequencing 方法。测序 reads 与 Cs10 参考基因组（GCA_900626175.2）比对，variant calling 使用 Torrent Suite software。使用 discriminant analysis of principal components（DAPC）和 phylogenetic analysis（基于 Euclidean 距离矩阵和 neighbor-joining tree）确定20个品种的遗传聚类。

表型分析

测量了20个农艺性状，分为四类：整株性状（株高、茎粗、分枝数和总花序产量）、顶端花序性状（顶端花序产量、面积、密度、每顶端 section 花序数和花序数/干重）、单个花序性状（花序重量、宽度、长度、体积、密度和每花序小花数）和开花时间相关性状（成熟天数）。表型参数在三个发育间隔测量：开花初期（孤花出现）、开花 initiation 后3周和成熟期（约70% pistil 变褐，50%以上 glandular trichome 从无色变为 milky）。

花序紧实度通过两种方法测定：顶端花序个体花序数与干重之比，以及花序面积与干重之比。单个花序紧实度通过解剖至少三个花序，提取、计数和称重其小花，测量宽度、长度和质量，计算密度。花序体积（V）基于圆柱形近似计算：V = πr²h，其中 r 为平均半径（cm），h 为平均长度（cm）。密度（D）计算为 D = m/V，其中 m 为质量（g），V 为体积（cm³）。

图像分析使用自定义数字图像分析方法：顶端花序（顶部25–30 cm）用数码相机捕获，导入 ImageJ，通过 hue（RGB）和 size-based thresholding 分割图像。测量参数包括 major axis（拟合椭圆的最长直径长度）和 convex hull area（包含分割对象的最小凸多边形面积）。计算形状描述符：圆度（4πA/P²）、长宽比（major axis/minor axis）和实度（area/convex hull area）。

统计分析

使用 R 进行统计分析和图形输出。通过 Shapiro–Wilk test 评估正态性，Levene's test 评估方差齐性。若符合正态性，使用 ANOVA（p < 0.05）；否则使用 Kruskal–Wallis test。使用 vegan package 进行 permutational multivariate analysis of variance（PERMANOVA）分析分类变量对多变量数据的影响。使用 corrplot package 进行 Spearman's rank correlation 分析。使用 metan package 构建基因型与环境互作（G×E）图，进行 meta-analysis 估计品种（遗传）和环境效应及其互作。

广义遗传力

使用三种方法估计广义遗传力（H2）：标准估计（H2_Standard，遗传方差与表型方差之比）、Piepho 方法（H2_Piepho，考虑数据不平衡和成对基因型 BLUEs 差异方差）和回归方法（H2_Reg，BLUPs 对 BLUEs 的回归系数）。方差分量基于线性混合模型计算，使用 lme4 和 emmeans packages。

结果

遗传关系分析

DAPC 分析揭示了三个 distinct 遗传聚类：Cluster I（Pure 1–5 和 7）、Cluster II（Pure 6,10,11,13,15,17）和 Cluster III（Pure 8,9,12,14,16,18–20）。Cluster I 仅包含 Δ⁹-THC-dominant 品种，而 Cluster II 和 III 包含 both high Δ⁹-THC 和 high CBD chemotypes。系统发育树显示了与 DAPC 相似的聚类模式，但有两个例外：Pure 7 与 Cluster III 品种分组（显示 admixture ancestry），Pure 11 与 Cluster I 分组（显示混合 ancestry）。

表型多样性

农艺性状在两个环境和品种间表现出差异响应。在 E1 中，所有三个生长阶段的株高和成熟时的分枝数增加，而大多数性状（开花早期的茎粗、总花序产量、成熟天数、顶端花序重量、花序数和顶端花序面积）在 E2 中增加。其他性状（花序质量、长度、体积、每花序小花数、每顶端 section 花序数和个体花序密度）在两个试验中相似。E2 中测量的性状标准偏差更大，表明变异性增加。

在遗传聚类水平上，20个性状中的11个（开花早期的株高、开花中期的株高、开花早期的茎粗、开花中期的茎粗、总花序产量、顶端花序产量和密度、每顶端花序花序数、个体花序重量、宽度和成熟天数）在遗传聚类间差异显著。在个体品种水平上，除分枝数外，所有性状均观察到显著差异。

性状变异的驱动因素

NMDS 分析显示，性状变异 largely 由环境塑造（沿 x-axis 清晰聚类）。基于 chemotype 的 NMDS 图聚类不明显，表明化学型与遗传相关性并不严格一致。基于遗传相关性的聚类模式在 E1 中更明显（Cluster I 和 II 形成相对 distinct 分组）。

PERMANOVA 分析表明，环境（E）和基因型（G）对农艺性状有显著影响，且基因型与环境的互作（G×E）对品种和遗传相关分组显著，但对化学型分组不显著。品种和环境的影响表明，约32%的变异由环境差异解释（R2_E = 0.32, p = 0.001），36%由品种（遗传背景）差异解释（R2_Gv = 0.36, p = 0.001），互作贡献11%（R2_Gv×E = 0.11, p = 0.003）。按遗传聚类分组时，38%的变异由环境解释（R2_E = 0.38），8%由遗传聚类本身解释（R2_G = 0.08），互作贡献4%（R2_G×E = 0.04, p = 0.015）。按化学型分组时，40%的变异由环境解释（R2_E = 0.40），4%由化学型差异解释（R2_C = 0.04, p = 0.006），互作不显著（R2_C×E = 0.01, p = 0.143）。

个体性状分析显示，对于大多数性状，环境影响在所有时间点（开花早期、中期和成熟期）高度显著（p < 0.05）。一些性状（开花中期和成熟期的株高、开花中期的茎粗、总花序产量、成熟天数、顶端花序产量、每顶端 section 花序数、顶端花序密度、个体花序重量和宽度）受遗传聚类显著影响。当按聚类分组时，互作效应仅在某些性状中观察到（如所有三个生长阶段的株高、开花中期和成熟期的茎粗、总花序产量、成熟天数、顶端花序产量和密度）。个体花序重量 solely 受其遗传聚类影响。

性状相关性

在两个环境中，两组变量 consistently 相关：株高和茎粗（E1: r = 0.36–0.55; E2: r = 0.52–0.54; p < 0.01），总花序产量和顶端花序产量（E1: r = 0.71; E2: r = 0.60; p < 0.01）。在 E1 中，顶端花序密度与个体花序重量（r = 0.62）、顶端花序产量（r = 0.54）和总花序产量（r = 0.43）显著正相关。在 E2 中，顶端花序密度与顶端花序产量（r = 0.84）、开花中期和成熟期的株高（r = 0.51 和 0.54）和开花中期的茎粗（r = 0.51）显著正相关。有趣的是，成熟天数与每顶端 section 花序数显著正相关（r = 0.44; p < 0.05）。花序密度与花序长度和体积在两个环境中均呈强负相关（E1: r = ?0.70; E2: r = ?0.51; p < 0.01）。

广义遗传力

三种方法计算的广义遗传力 estimates 显示，所有三个生长阶段的株高 exhibit 高遗传力（0.81–0.92），表明强遗传影响。所有三个生长阶段的茎粗 exhibit 中等至高遗传力（0.43–0.80），个体花序质量显示中等至高遗传力（0.62–0.74）。一些性状在不同方法间差异较大：成熟天数（0.24–0.51）、顶端花序产量（0.25–0.49）、花序数（0.28–0.41）、每顶端 section 花序数（0.39–0.54）和顶端密度（0.43–0.58），其中 H2_Piepho 和 H2_Standard 估计通常产生比回归方法更高的 H2 值。个体花序性状（花序长度、体积、宽度和每花序小花数）的遗传力 generally 低于营养性状（除花序质量外）。

农艺性状稳定性

性状稳定性受品种、环境及其互作影响。Pure 11 在 E1 中大多数性状（株高、总花序产量、顶端花序面积、个体花序质量、宽度、长度和体积）的生长 consistently greater than in E2。品种分析显示，基于平均顶端花序产量和顶端花序密度，在不同环境中表现最佳的品种不同：Pure 11 在 E1 中积累最大花卉质量，Pure 5 在 E2 中最多；Pure 18 在 E1 中 exhibit 最大花卉密度，Pure 5 在 E2 中。E2 中没有单一品种在所有测量的农艺性状上产生 consistently 更高平均值。

尽管化学型倾向于掩盖某些性状的基因型与环境互作，但一些显著相关性被识别，例如花序质量、顶端花序产量、每顶端 section 花序数和茎粗、开花早期的株高和成熟期的株高。Δ⁹-THC-dominant 品种在两个环境中表现出显著更大的顶端花序产量 than CBD chemotypes。

线性模型拟合表明，环境（p < 0.001）和品种与环境的互作（p = 0.001）显著影响顶端花序产量。E2 中增加的花序产量表明这是更有利的环境。然而，尽管 E2 中平均花序产量更高，但花序质量受到两个环境开花后期称为狐尾化的松散花卉簇结构的影响。进一步分析显示，一些品种在两个环境中对平均花卉产量表现出稳定性，包括 Pure 1,2,6,8,9,10,12,14,18,19。

从图像分割分析中提取的几个测量参数（面积、周长、圆度、圆形度和实度）被识别为大小和紧实度的潜在指标。三个参数——面积（r = 0.87）、周长（r = 0.75）和实度（r = 0.80; p < 0.05）——与顶端花序产量显著相关，而面积（r = 0.37）、圆度（r = 0.36）和实度（r = 0.36; p < 0.05）与顶端花序密度显著相关。

几个品种在两个环境中表现出狐尾化。在 E2 试验中，15个品种（Pure 2–3,6,8,10–20） exhibit 狐尾化，而在 E1 试验中只有五个（Pure 3,10–11,13–14）。总共有五个品种在两个环境中 display 狐尾化（Pure 3,10,11,13,14）。分析狐尾化对顶端花序产量和密度的影响表明，当狐尾化存在时，顶端花序密度与实度（r = 0.72; p < 0.05）和面积（r = 0.69; p < 0.05）显著相关。这表明尽管狐尾化花序外观松散，但这些花序 maintain 一定程度的 structural integrity。与实度的显著相关性表明，尽管花朵 elongate，它们仍 maintain 一致的 mass-to-volume ratio。此外，顶端花序产量与面积（r = 0.94; p < 0.05）、周长（r = 0.64; p < 0.05）和实度（r = 0.80; p < 0.05）显著相关。总体而言，花序密度不一定降低总产量，表明花卉产量受狐尾化的影响小于花卉密度。它进一步表明，诱导狐尾化的环境因素改变生长模式而不损害花卉质量。

讨论

研究大麻农艺性状变异的驱动因素对植物产量和 cannabinoid 生产具有广泛意义。由于历史上产业的非正式性，对本研究中使用的大麻品种的 heritage 和 ancestry 知之甚少。然而，可以合理假设这些植物表现的许多商业重要特征（如 Δ⁹-THC:CBD 比率）是 targeted breeding 和 domestication 努力的结果。检测到三个 distinct 遗传聚类，由于一些品种中存在 admixture，观察到聚类间的基因流动。这支持了 McPartland 和 Small 的发现，即大麻品种的广泛杂交和旨在最大化 cannabinoid 含量的努力可能 disrupt 了化学型之间的遗传差异。本研究类似地表明，杂交育种导致了大麻显著的表型重叠，表明仅凭形态学可靠地确定 phytochemical profile 在商业大麻品种中很困难。尽管我们的研究结果表明花序形态在品种间相似，但已知某些性状在商业品种中更稳定。

尽管对形态性状均匀性的强烈选择，大麻对环境因素表现出显著的变异性，显示形态和生长模式的显著变化。然而，这种变异性在受控环境中比在可变环境中更好管理。我们的研究结果在 distinct 环境（高度受控 E1 与可变温室 E2 条件） across 大麻品种中识别出差异表型响应的类似趋势。环境在驱动农艺性状中起主导作用（R2 = 32%–40%），因为许多性状——包括整株性状（如株高）、花序性状（如顶端花序产量）和一个开花性状（成熟天数）——受环境影响显著。在可变环境条件下，营养生长显著减少，而生殖生长增加。这种生殖生长的优先化很可能通过在次优条件下将资源从营养生长转移到花卉发育来确保早期阶段 pollination。有趣的是，形态分化仅在受控环境中明显，在可变条件下减弱，突出了基因型与环境互作的重要作用，而基于化学型的分组在两种情况下均未显示空间结构。这强调了在定义育种群体或预测农艺性能时整合遗传数据而非仅依赖化学型分类的重要性。

尽管由于环境，大多数农艺性状出现显著变异，但一些性状也表现出很大比例的表型变异 due to 遗传影响。使用三种不同方法计算个体性状的广义遗传力值。H2_Standard 方法假设平衡数据，不考虑复杂性——如基因型与环境互作——这可能导致低估或高估，例如花序体积。相比之下，H2_Piepho 和 H2_Reg 方法 incorporate 这些复杂性，使它们在 unbalanced datasets（通常在大规模农艺试验中）中更可靠地估计遗传力。对于大多数营养性状，广义遗传力估计范围从中等（H2 = 0.3–0.5）到高（H2 > 0.5），这与 Naim-Feil 等人的发现相呼应。这表明尽管这些性状的很大一部分变异 due to 环境，但观察到的表型变异的相当大比例可归因于品种间的遗传差异。然而，在不同环境中营养性状的差异响应突出了基因型与环境互作对表型表达的复杂性。一些性状（如顶端花序产量）在不同方法间观察到 large variation，而其他性状（如株高）在所有三种方法中一致，突出表明这些估计高度情境依赖，取决于所测量的性状（以及如何测量）以及基因型与环境互作等因素。这种变异性， along with 农艺性状的多基因性质，表明具有微小但 varied 效应的多个基因可能导致表型变异性，这一点由 de Ronne 等人强调。鉴于性状一致性对农民的重要性，专注于具有高广义遗传力的性状的育种努力将是实现和维持 desired 性状的有用策略。

除花序宽度外，其他个体生殖性状在受控或可变环境间没有变化，但所有性状的广义遗传力估计值 notably 低于营养性状（H2 < 0.3）。大麻生殖性状的类似低广义遗传力（0.1–0.33）先前由 Naim-Feil 等人证明。这些性状缺乏可测量的环境影响表明，低遗传力主要是遗传约束的结果，如 stabilizing 或 negative selection，这 expected 减少基因型间的遗传分化。此类生殖性状很可能 under 遗传约束 due to 它们与 fitness 的直接相关性，这将优先考虑可变条件下的表型稳定性。有趣的是，这项研究强调生殖性状在两个环境中高度相关，表明尽管环境变异，仍存在一定程度的遗传稳定性。例如，个体花序重量与其他花卉属性（如顶端花序密度、总花序以及顶端花序重量）显著正相关。在这项研究中，一些品种表现出花序稳定性；然而，很明显，没有一个品种适合两种环境，除了 Pure 4，它在两个环境中排名 top performer。一致的表现表明该品种 exhibit 更稳定的花序产量架构，指向其 across 可变环境的稳健性。顶端花序性状响应环境表现出相当大变异，表明遗传影响有限。然而，个体花序重量——与其他生殖性状相比具有最高广义遗传力——将是育种者 target 的合适性状。鉴于较大的花序已被证明对总花序产量有显著贡献，这些数据表明产量可能通过选择性育种个体花序重量得到改善。然而，需要估计狭义遗传力以进一步划分加性方差与显性和上位效应，以预测此类育种计划的成功。

尽管在可变环境（E2）中平均产量 consistently 更高，但植物也表现出更大的花序形态变异，这影响了花序密度。在商业大麻产业中，花序密度影响花卉产品的价值。这可能是因为松散的花序通常 coupled with 更多叶片材料，因此 cannabinoid 浓度不一致。虽然文献描述了这种不规则花卉架构，但它没有明确提供描述该性状的术语， colloquially 称为狐尾化。这项研究指出，这种表型的 prevalence 在 E2 中更大，表明花序性状由环境驱动。虽然环境因素可能诱导花序性状的短期变异性，但这些性状先前证明了长期区域适应。例如，来自更潮湿地区的大麻植物往往 display 更松散的花序结构，作为减少对 favor 潮湿微气候的真菌病原体易感性的手段，与来自较干燥地区的品种产生紧密包装的花序相比。因此，从进化 perspective，该性状必须是大麻确保生殖成功的适应策略的一部分。在一些群体中，一个属于 MIKC-type MADS 亚家族的转录因子（CsMIKC1）已被证明表现出类似的花卉形态变化，因此表明环境和遗传共同驱动该性状变异。这项研究证明五个品种（Pure 3,10,11,13,14）在两个环境中 display 相同的狐尾化表型，尽管它们不在同一遗传聚类中，但它们 exhibit admixture（除了 Pure 10 和 13），表明一些遗传元素的共享 heritage 可能 contribute to 性状表达。

利用图像分析创建可靠表型分析有助于选择在多变环境中保持表型一致性的基因型。本研究开发的表征花序密度的新方法帮助识别了与更紧密花序相关的表型标记。例如，我们发现面积（r = 0.37）、圆度（r = 0.36）和实度（r = 0.36）都与顶端花序密度显著相关，可用于在收获期间识别狐尾化。该性状不仅降低品质，而且使生产的某些方面复杂化，因为持续产生 pistil 使得确定成熟度变得困难。因此，这种生长模式使确定最佳收获时间复杂化，并对药物型材料的收获后实践（如使用机器修剪）构成挑战。使用图像分析技术可用于识别大麻品种间花卉形态的差异。这将帮助识别影响这些性状的位点，并通过标记辅助选择加速育种，以减少此类松散花卉结构的普遍性并改善其他花卉性状。

收获和干燥花序的质量感知影响 cannabinoid 产品的市场价值。这项研究的结果揭示了环境变异和多种大麻品种的遗传构成对 several 农艺和花卉性状的影响，这些性状可能影响生产效率和盈利能力。尽管大麻花序发育的遗传架构尚未完全了解，但最近的研究发现了与开花行为相关的基因， involved in 花序分生组织 identity 的 initiation 和 maintenance。详细的遗传分析可能帮助选择最适合特定栽培条件的品种，使生产者能够减轻与在不熟悉环境中表现不佳的品种种植相关的财务风险。这些见解有助于更广泛地理解影响花序品质的因素，并可为未来的育种计划和栽培策略提供信息，帮助确保一致、高质量的产量，同时减轻固有行业风险。