射频协同酶解增效玉米不溶性膳食纤维：发酵特性与短链脂肪酸生产的突破性研究

本综述系统探讨了射频加热（RF）与酶解（EH）协同处理对玉米不溶性膳食纤维（IDF）的增效机制。研究证实，该联合处理能显著改变IDF结构，提升其发酵能力，促进肠道微生物群（如Prevotellaceae）增殖，并大幅增加短链脂肪酸（SCFA）产量（24h达62.65 mM，增幅40.78%），为开发功能性食品与改善代谢健康提供了创新策略。

　　

引言

现代西方饮食模式导致普遍存在的“膳食纤维缺口”，多数人未能达到FDA推荐的每日膳食纤维摄入量标准（男性38克，女性25克，儿童19克）。膳食纤维作为一种不可消化的碳水化合物，对胃肠道健康至关重要，具有调节血糖、促进饱腹感和通过发酵产生短链脂肪酸（SCFA）如乙酸、丙酸和丁酸来支持平衡的肠道微生物群的作用。

膳食纤维通常分为可溶性膳食纤维（SDF）和不溶性膳食纤维（IDF）。SDF存在于燕麦、豆类和水果中，溶于水形成凝胶，减缓消化，降低胆固醇，并作为有益肠道细菌的益生元。相比之下，IDF富含于全谷物和蔬菜中，增加粪便体积并促进规律排便，但由于其致密、刚性结构，发酵性较差。

玉米IDF，特别是来自玉米蛋白粉（CGM）的IDF，是玉米湿磨加工的副产品，体现了这些挑战。虽然CGM因其蛋白质含量在动物饲料中受到重视，但其IDF由于刚性基质限制了保水性和微生物发酵性，在人类食品中未得到充分利用。这种未充分利用代表了食品工业中价值增加和收入生成的错过机会。

增强IDF的发酵性需要物理、化学和生物处理，每种方法都有其独特的优势和局限性。物理方法如粉碎和研磨增加了表面积和微生物可及性，但由于热暴露可能导致营养损失。挤压结合热和机械剪切改善了发酵性，但能耗高且会降解热敏感营养素。蒸汽爆破和高压灭菌也破坏了纤维结构，但可能导致显著的营养损失。化学处理包括酸或碱水解，可以改变纤维溶解度和生物活性，但可能产生不良副产物。氧化处理改善了发酵性，但可能产生有害氧化产物。生物方法如酶水解（EH）使用纤维素酶和木聚糖酶等酶来分解纤维，增强了保水能力和溶解度。尽管EH是环保和特异的，但成本高且难以规模化。微生物发酵可以进一步增强发酵性，但需要精确控制以确保一致性。

结合射频（RF）加热与EH为IDF改性提供了一种有前景的策略。RF加热在13.56、27.12和40.68兆赫等频率下运行，通过与极性分子相互作用产生热量，确保快速均匀的温度分布。与传统的热方法不同，RF加热以最小的热降解高效靶向纤维结构，使其成为EH的能量高效预处理。RF加热破坏了纤维素、半纤维素和木质素中的氢键，降低了纤维刚性并增强了酶可及性。然后EH进一步分解纤维成分，暴露亲水基团，增加了溶解度和微生物可及性。虽然EH alone是环保和特异的，但其高成本和可扩展性问题是障碍。RF预处理可以通过减少酶需求和处理时间来提高EH效率，从而优化纤维功能用于高纤维食品、营养药品和益生元配方。

RF/EH方法的新颖之处在于其协同应用了靶向、能量高效的RF预处理，然后是EH。与传统的物理或热方法不同，这些方法通常导致营养损失或需要高能量输入，RF加热提供快速均匀的能量，保存热敏感营养并有效破坏纤维结构。该过程避免了化学和氧化处理的缺点，如副产物形成和安全问题。通过使纤维更易于酶攻击，RF/EH方法减少了酶需求和处理时间，导致增强的溶解度、改善的发酵性和增加的SCFA生产。

总之，RF/EH方法代表了一种新颖、可扩展和可持续的解决方案，用于将未充分利用的玉米副产品转化为功能性、可发酵的膳食纤维，解决纤维缺口同时支持肠道健康，并为食品工业中的价值增加提供新机会。

目标

本研究旨在通过应用27.12兆赫的RF加热，然后是使用α-淀粉酶和蛋白酶的EH，来增强来自CGM的玉米IDF的发酵性和健康益处。具体目标是：

表征结构改性——研究RF + EH对玉米IDF的纤维组成、颗粒形态和分子相互作用的影响，评估可能增强其生物利用度和发酵性的变化。

评估微生物多样性——检查RF + EH如何在体外发酵过程中影响肠道微生物群组成，重点关注参与SCFA生产的细菌群落。

分析SCFA生产——测量和比较处理IDF发酵过程中产生的SCFA水平（乙酸、丙酸、丁酸），以评估其发酵性和潜在益生元效应，使用来自人类捐赠者的粪便微生物群。

材料与方法

玉米蛋白粉（CGM）

CGM是玉米磨粉的副产品，是一种丰富且廉价的纤维来源，主要用于动物饲料，因其高蛋白质含量，通常价格在每公吨500至700美元之间。它还用于植物基蛋白补充剂、可生物降解材料，以及作为天然除草剂。然而，其致密、难溶和最小发酵性的玉米纤维限制了其在需要增强水合、质地和稳定性的高价值食品工业中的应用。CGM被选为此项目 due to其丰富的纤维含量，提供了一种成本效益高的材料来探索功能性的潜在改进。CGM从Primient（Lafayette, IN, USA）采购，并在使用前储存在黑暗、密封的容器中，室温26°C。

不溶性膳食纤维（IDF）制备

CGM按照AOAC方法991.43处理获得IDF组分。干燥的CGM（水分含量<5% w.b.）使用Cyclotec 1093磨粉机（Foss A/S）研磨，并通过0.8毫米筛网以获得均匀的颗粒大小。选择0.8毫米筛网以通过增加酶作用表面积来优化提取效率，同时最小化加工过程中细颗粒的损失。均匀的颗粒大小对于重现性和准确的膳食纤维分析很重要。

将磨碎的膳食以1:10（w/v）的比例悬浮在水中，并加热至90°C。加入热稳定α-淀粉酶（4 mL; Sigma A3403），混合物在搅拌下孵育2小时以水解淀粉。然后再加入4 mL α-淀粉酶，继续孵育另外4小时以确保完全淀粉水解。此步骤破坏了纤维基质内的分子间氢键和酯键。

在α-淀粉酶处理后，悬浮液在4000 × g下离心10分钟（Sorvall ST 8R离心机）。去除可溶部分，不溶残渣重新悬浮在水中（1:10 w/v），冷却至50°C，并用5 mL蛋白酶（Sigma P1236）处理4小时，连续搅拌以分解蛋白质组分并进一步 loosening 酯键。

在蛋白酶处理后，悬浮液再次在4000 × g下离心10分钟。在所得不溶纤维组分上重复α-淀粉酶和蛋白酶处理以最大化去除淀粉和蛋白质。然后将最终IDF悬浮在水中（1:5 w/v），用蒸馏水和80%乙醇洗涤，并冷冻干燥以获得纯化IDF。此IDF的一部分留作后续RF处理和进一步EH。

射频（RF）处理

射频（RF）单元

用于进行本研究的中试平行板RF加热系统（1.5 kW, 27.12 MHz; Model: SO-6B, Proctor Strayfield）的示意图如图1所示。RF系统包括一个顶部和底部电极，样品置于其间。顶部电极具有可调的产品到发射器间隙，而底部电极在处理过程中支撑样品。传送带（长度：162.56 cm），以红色轮廓表示，连续移动样品通过RF处理区。RF单元本身的宽度为60.96 cm，高度为68.58 cm，长度为162.56 cm，内部体积约为679,518.62 cm3。这些尺寸对于理解中试应用中的能量分布和处理均匀性至关重要。

选择205毫米的产品到发射器间隙大小以优化加热而不损害食品质量。样品置于高密度聚丙烯托盘（图2）中，确保适当暴露于RF场。连接光纤传感器以确定RF加热过程中的均匀温度分布。

射频（RF）暴露参数

功率密度（S）（W/m2，W/kg，或W/m3）

功率密度（S）量化了RF暴露期间传递给样品单位质量（或根据上下文，单位面积或体积）的能量量。通常使用以下公式计算：S = P / m，其中S是功率密度（W/kg）；m是样品质量（kg）；P是传递给样品的总功率（W）。

比吸收率（SAR）

SAR测量了RF暴露期间样品单位质量吸收的能量。在此上下文中，可以计算为：SAR = P_abs / m，其中SAR是比吸收率（W/kg）；P_abs是样品吸收的功率（W）；m是样品的质量（kg）。

如果产品和RF发射器之间存在间隙（例如，由于样品在托盘中的放置），则间隙体积（V_g）为：V_g = A * g，其中A是托盘的横截面积（m2），g是产品到发射器间隙大小。

调整后SAR（SAR_Adjusted）

SAR_Adjusted反映了样品随时间累积吸收的RF能量。为每个处理持续时间（40、50和60分钟）确定了SAR_Adjusted值（表A1）。计算为：SAR_Adjusted = SAR * t，其中t是处理时间（s）。

电场强度（E）

电场强度（E）代表了RF暴露期间样品内电场的强度。此公式整合了产品到发射器间隙的物理尺寸和样品的电磁特性，以量化RF处理过程中施加的电场强度。平方根关系突出了场强对施加功率P的依赖性，并与样品渗透性、光速和有效间隙面积的乘积成反比。使用以下公式计算：A_g = V_g / g，其中A_g是有效间隙横截面积（m2）；V_g是产品到发射器间隙的体积（m3）；g是产品到发射器间隙大小（m）。E = sqrt( (2 * P) / (μ * c * A_g) )，其中E是样品内的电场强度（V/m）；P是施加到样品的功率（W）；μ是样品渗透性（H/m）；c是真空中的光速（3 × 10^8 m/s）。

有效电场强度（E_Eff）

E_Eff是电场强度的均方根（RMS）值。计算为：E_Eff = E / sqrt(2)。

表A1提出了CGM的RF辅助处理的实验设计条件，重点关注关键参数如调整后SAR、S和E_Eff。这些值针对各种RF处理条件确定，包括电极间隙、加热持续时间和一致的RF功率（1.5 kW）。下表

温度监测

RF处理过程中的温度曲线使用光纤传感器（Omega Engineering, Inc., Stamford, CT, USA）监测，以确保均匀加热并最小化热降解风险。

射频（RF）处理不溶性膳食纤维（IDF）的酶水解（EH）

为了进一步分析，制备的IDF的一个子集进行了RF处理。然后将RF处理的IDF悬浮液（1% w/v）进行顺序EH如下：

蛋白酶处理：RF处理的IDF与蛋白酶（P1236, Sigma）在0.1 U/g IDF下在50°C孵育4小时，然后煮沸15分钟以灭活酶。

阿魏酸酯酶处理：样品随后用阿魏酸酯酶（E-FAEZCT, Megazyme）在30 U/g IDF下在50°C处理4小时，然后煮沸15分钟。

在每个酶步骤后，悬浮液在8000 × g下在4°C离心20分钟，收集上清液用于分析。剩余残渣干燥过夜直至达到恒定重量。

体外发酵

体外发酵基于Lebet等人的方法进行修改自Rose等人。纤维底物（RF = 射频处理；RF + EH = 射频 + 酶处理）在37°C下厌氧孵育0、6和24小时，120 rpm，使用来自三名健康捐赠者的粪便 slurry，这些捐赠者消费常规饮食且在过去3-6个月内未服用抗生素。其中两名捐赠者为男性，一名为女性，年龄范围26-38岁（平均30岁）。所有捐赠者体重指数（BMI）均在正常范围内（18.5-25 kg/m2）。粪便样品收集在无菌塑料管中，立即密封，置于冰上，然后转移到厌氧室（BactronEZ Anaerobic Chamber; Shel Lab, Cornelius, OR），在那里进行体外粪便发酵。所有样品在收集后1小时内用于发酵。人类粪便收集和使用经普渡大学机构审查委员会批准（IRB协议号1510016635）。制备厌氧碳酸盐-磷酸盐缓冲液并用于 overnight 水合底物。加入粪便 slurry，并在0、6和24小时测量气体生产。用硫酸铜停止发酵，并测量pH。收集样品用于SCFA分析并在-80°C冷冻用于DNA提取。包括阳性对照（低聚果糖[FOS]）和阴性对照（空白，无底物） alongside 玉米纤维样品。在发酵过程中，在0、6和24小时收集2 mL样品用于进一步分析。

短链脂肪酸（SCFA）定量

SCFA（乙酸、丙酸和丁酸）从粪便 slurry 中定量，如Cantu-Jungles等人所述。离心后（13,000 rpm, 10分钟），将4 μL上清液注入HP 5890气相色谱仪（GC），配备Nukol毛细管柱（30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm bonded phase; Supelco, Bellefonte, PA, USA）。GC条件包括进样器和检测器温度230°C，初始炉温100°C，以8°C/min升温至192°C并保持3分钟。氦气作为载气，流速0.75 mL/min。SCFA使用火焰离子化检测器（FID）定量，并相对于内标（4-甲基戊酸）基于峰面积计算。

为了确保处理间的一致性，SCFA浓度标准化为添加到每个发酵的碳水化合物量（每样品50 mg）。最终值（mM）基于样品体积中的SCFA浓度并按50 mg碳水化合物输入调整。

微生物种群表征

DNA提取

从体外发酵0、6和24小时收集的粪便样品中提取DNA，使用FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals, Solon, OH, USA）按照制造商协议进行，略有修改如Cantu-Jungles等人所述。简言之，每次提取使用300 μL粪便 slurry。提取的DNA通过酒精沉淀纯化，稀释至1–50 ng/μL浓度范围，并置于96孔板中。使用NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA）测量DNA浓度。然后将样品送到Rush University Medical Center（Chicago, IL, USA）的研究生物信息学核心进行16S rRNA基因V4区域的扩增子测序。测序使用双重PCR策略进行。第一次PCR用包含共同序列（CS1_515F和CS2_806R）的通用引物扩增基因组DNA，然后是第二次PCR使用带有Illumina测序适配器和样品特异性条码的引物。PCR反应使用AccuPrime SuperMix II（Life Technologies）在20 μL体积中进行第一阶段，10 μL体积进行第二阶段。PCR条件如下：初始变性95°C 5分钟，随后第一阶段28个循环，第二阶段8个循环，变性95°C，退火55–60°C，延伸68°C。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，合并，并使用AMPure XP Beads纯化。纯化产物然后准备进行Illumina测序，并进行数据分析以评估微生物多样性和组成。

微生物分析

16S rRNA基因序列数据的处理和分析使用先前研究中建立的方法进行。简言之，原始序列数据导入CLC Genomics Workbench（QIAGEN, Redwood City, CA, USA）进行质量修剪（Q20），并去除短于200碱基的读取。每个样品生成超过30,000个高质量读取。处理后的数据然后使用QIIME2和USEARCH聚类算法（UCLUST）以97%相似性阈值进行操作分类单元（OTU）聚类。针对Greengenes参考数据库（版本13.8）进行序列注释。后续步骤包括过滤低质量序列，去除嵌合序列，并将高质量读取聚类成OTU。最后，使用R中的Phyloseq包（版本4.3.1）和JMP进行α多样性、β多样性和分类丰度分析。

统计分析

IDF样品（处理和天然）的体外发酵进行三次重复。结果表示为平均值±标准差。对于不同组之间的统计比较，采用单因素方差分析（ANOVA），随后在95%置信水平（p < 0.05）下进行Tukey's HSD事后检验。使用JMP（JMP Pro 16.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）进行统计分析。

结果与讨论

优化射频（RF）暴露参数

功率密度（S）

S保持在17,647.06 W/m2，与报道的RF应用值一致，如水稻干燥达到300,000 W/m2。尽管此值超过了典型的RF范围100–1000 W/m2，但它优化了能量分布而不诱导过度美拉德反应或破坏纤维结构。生物质热解和RF/MW加热的类似研究支持使用更高功率密度以防止热降解并提高能量效率。

比吸收率（SAR）

样品表面积为850 cm2（0.085 m2），间隙体积为5.08 cm，样品堆积密度测量为476.19 kg/m3，这在先前研究报告的可接受范围内。

SAR一致为729.51 W/kg，调整范围从1750.81到2626.22 W/kg。最佳调整后SAR为1750.81 W/kg，提供了足够能量破坏IDF结构同时避免热降解。SAR直接影响纤维改性程度和发酵性。据报道，500–2000 W/kg范围内的SAR值增强了多糖链的可及性并增加了可溶性纤维含量，从而通过肠道微生物群改善了发酵性。超过2000 W/kg可能导致不均匀加热和纤维功能损失，由于热降解和改变的纤维结构可能降低发酵性。因此，将SAR保持在最佳范围内对于最大化玉米IDF的发酵性同时保留其功能特性至关重要。

电场强度（E_Eff）

E_Eff范围从105.49到136.183 kV/m，较小电极间隙产生较高E_Eff值。最佳E_Eff为136.183 kV/m，在3.81 cm电极间隙实现，最大化了能量吸收和均匀加热——两者对于有效改性IDF结构至关重要。尽管较小电极间隙可以进一步增加E_Eff，但它们也增加了不均匀加热和潜在纤维降解的风险，如功能特性下降和可能的热损伤所示。因此选择此水平以平衡能量输入与纤维质量，与实验结果和文献一致，表明最佳电极间距和场强对于类似过程中高效安全能量应用关键。

支持射频（RF）参数优化的物理化学证据

S、SAR和E_Eff选择通过物理化学证据验证，证明了改进的IDF改性和可及性。优化RF预处理（S = 17,647.06 W/m, SAR = 1750.81 W/kg, E_Eff = 136.183 kV/m）将中值颗粒大小减少了39%（从320.88到196.32 μm），并将比表面积加倍（从0.0309到0.0744 m2/g），增强了酶效率。RF + EH处理将SDF增加了50%（4.2%对比EH alone的3.6%），将IDF含量降低到42.4%，并改善了保水能力（4.96%对比对照3.09%），同时保持结构完整性并增加无定形区域。SEM和XRD证实了孔隙率和结晶度增加，颜色分析（ΔE = 14.59）指示了进一步的结构变化。与传统方法相比，RF + EH消除了化学残留并最小化了营养损失，为功能性纤维生产提供了可扩展、能量高效的解决方案。

微生物多样性和群落分析

Alpha多样性指数和微生物丰富度

使用Chao1、观察特征、Shannon和均匀度指数评估Alpha多样性（表A3；图A3-A6）。Alpha多样性指的是特定区域、生态系统或样品内的物种多样性，通常通过存在的物种数量（物种丰富度）和这些物种间个体分布（均匀度）来测量。它提供了生物多样性的局部尺度评估，提供了对群落结构复杂性和健康的洞察。

对照（CTRL）指的是未应用任何膳食纤维处理或改性的基线对照组。此组代表了标准微生物群落组成和多样性，作为评估所有实验处理效果的参考点。

POOL指的是通过合并所有处理组的等分试样创建的汇集样品组。此复合样品提供了所有实验条件下微生物群落的平均表示，允许与个体处理和对照进行比较。

CTRL表现出最高的物种丰富度（Chao1 = 236, 观察特征 = 226），其次是FOS、POOL和RF + EH，而RF和BLANK显示出显著较低的丰富度。Shannon指数揭示了CTRL（6.17）、RF + EH（6.15）和POOL（6.14）的最高多样性，而RF和BLANK表现出较低多样性，表明RF + EH增强了微生物丰富度。

主坐标分析和微生物组成变化

主坐标分析（PCoA）显示RF + EH与CTRL和FOS聚类相似（图A7），表明可比的微生物组成。RF和BLANK形成 distinct 聚类，突出了RF + EH ability to modulate gut microbiota similarly to prebiotic treatments。此处理增加了与丙酸生产相关的Prevotella丰度， favoring gut microbial health。增加的拟杆菌门比例进一步表明RF + EH增强了肠道功能并支持有益细菌生长。

微生物群落组成和肠道健康影响

门水平变化：厚壁菌门和拟杆菌门

厚壁菌门在BLANK处理中最丰富（74.59%），而拟杆菌门在POOL（24.72%）和RF + EH（24.83%）中更普遍（表A2；图A8），表明肠道微生物群落发生了有利转变。在所有处理中观察到微小比例的变形菌门和放线菌门，反映了一个稳定和有弹性的微生物生态系统。

短链脂肪酸（SCFA）谱和肠道健康结果

如BLANK和FOS处理中所见，更高丰度的厚壁菌门与丁酸产量增加相关。丁酸是一种关键的SCFA，支持肠道屏障完整性，减少炎症，并为结肠细胞提供能量。相比之下，以较高拟杆菌门为特征的RF和RF + EH处理 favored 丙酸生产。丙酸与改善的葡萄糖代谢、食欲调节和降低代谢疾病风险相关。

更平衡的厚壁菌门/拟杆菌门比例和多样化的SCFA谱——尤其是丙酸与丁酸一起增加——表明增强了代谢和肠道健康益处。这些微生物变化有助于维持更健康的肠道环境，支持免疫功能，并降低肥胖和代谢紊乱的风险。

短链脂肪酸（SCFA）生产和营养影响

时间短链脂肪酸（SCFA）生产动态

FOS显著促进了SCFA生产，乙酸、丙酸和丁酸水平均从6小时增加到24小时（图A1和A2）。RF + EH处理也增强了SCFA输出，同期所有三种主要SCFA均有显著增加。重要的是，RF + EH将膳食纤维发酵性提高了40.78%，从43.65到62.65 μmol每50 mg碳水化合物（表A4；图A1和A2）。

增强的纤维发酵性和代谢益处

SCFA对于肠道能量代谢和整体肠道健康至关重要。它们作为结肠细胞的能量来源，加强肠道屏障，减少炎症，并支持免疫功能。增强的SCFA生产，尤其是改善的纤维发酵性，与降低代谢和炎症疾病风险相关。

综合健康影响

总之，这些发现表明FOS和RF + EH处理都促进了肠道微生物群的有益变化并显著提高了SCFA生产。这些变化与改善的肠道屏障功能、代谢健康和免疫支持相关，突出了这些处理通过微生物组调节和增强膳食纤维利用来促进整体人类健康的潜力。

结论

本研究证明了不同处理对微生物群落组成、多样性和SCFA生产的显著影响。RF暴露参数的优化，特别是SAR和E_Eff，已被证明是增强能量分布、微生物多样性和SCFA生产的有效手段，而不会引起热降解。

RF + EH处理显著增加了微生物丰富度和多样性，与FOS处理相当，并促进了肠道微生物群组成的有益变化，特别是通过增加拟杆菌门的丰度。这种变化与SCFA（如乙酸、丙酸和丁酸）的产量增加相关，这些SCFA在肠道健康和代谢调节中起着关键作用。RF + EH处理尤其展示了其增强纤维发酵性和支持有益微生物种群生长的潜力，有助于改善肠道健康。

研究结果还强调了处理对微生物多样性的 varying effects，CTRL组表现出最高多样性，其次是FOS、POOL和RF + EH处理。相比之下，BLANK和RF处理显示出较低多样性和SCFA生产，表明这些处理可能不支持最佳肠道微生物活动。

总体而言，研究强调了RF + EH处理在通过增强微生物多样性和SCFA生产促进肠道健康方面的潜力，为改善膳食纤维发酵和支持代谢健康提供了一种有前景的方法。需要进一步研究来探索这些处理对肠道健康的长期影响及其在食品和营养中的更广泛应用。

结合RF加热和EH通过增加SCFA生产和丰富有益肠道细菌显著增强了玉米IDF的发酵性。这使得处理后的纤维成为促进消化健康的理想功能成分。这种可扩展、可持续的方法为开发高纤维食品、营养药品和具有改善营养益处的益生元配方提供了一种成本效益高的解决方案。