PAQR4：膀胱尿路上皮癌中调控细胞衰老、免疫逃逸与转移的关键基因及其临床意义

本综述深入探讨了细胞衰老相关基因在膀胱尿路上皮癌（BLCA）中的重要作用，重点揭示了PAQR4作为新型生物标志物的价值。研究通过整合TCGA和GSE（GSE13507）数据集，结合机器学习算法（如CIBERSORT免疫浸润分析）和实验验证（qRT-PCR、Transwell等），证明PAQR4的高表达与BLCA患者不良预后、免疫抑制微环境及肿瘤转移密切相关。该研究为BLCA的精准诊断、预后评估及免疫治疗（如ICB疗法）提供了新靶点，具有重要的临床转化意义。

　　

引言

膀胱尿路上皮癌（BLCA）是全球泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第九位，且呈逐年上升趋势。据2023年癌症统计数据显示，美国每年约有82,290例新发BLCA病例，并导致约16,710例死亡。BLCA的高复发率和治疗复杂性使其成为临床管理的重大挑战。目前诊断方法如膀胱镜活检具有侵入性，而非侵入性尿液生物标志物的敏感性和特异性仍不足。因此，开发更精确的诊断和治疗生物标志物对于改善早期筛查、疗效评估和复发监测至关重要。

细胞衰老在肿瘤形成和进展中扮演复杂角色。在BLCA中，衰老通过细胞周期永久性停滞抑制癌细胞增殖，这一过程受多个基因和信号通路调控。然而，细胞衰老的影响不仅限于肿瘤抑制，衰老相关分泌表型（SASP）在特定情况下可促进肿瘤进展和转移。在BLCA背景下，细胞衰老与肿瘤免疫治疗疗效显著相关。研究表明，衰老细胞可通过分泌多种因子改变肿瘤微环境，影响免疫系统反应。这些因子可招募免疫细胞清除衰老细胞，从而减少肿瘤形成和扩张；但若清除延迟，可能导致免疫抑制环境，支持肿瘤进展。细胞衰老的特征是p53信号通路激活，伴随细胞周期抑制剂p21的上调，以及增殖标志物KI67的抑制。本研究通过分析p53和KI67表达水平识别BLCA中的衰老相关样本，发现差异表达基因，并利用机器学习方法和实验验证确认PAQR4的关键作用。

材料与方法

本研究使用TCGA-BLCA和GSE13507两个数据集。TCGA-BLCA包含406个BLCA样本和19个正常膀胱组织样本，GSE13507包含165个BLCA样本和9个正常样本。聚类分析使用ConsensusClusterPlus进行，基于1-Pearson相关距离度量，采用聚合PAM聚类，80%样本重采样10次。免疫浸润分析使用immunedeconv R包和CIBERSORT算法。诊断和预后模型通过多种机器学习算法构建，训练数据来自TCGA-BLCA，验证使用GSE13507，以曲线下面积（AUC）评估性能。

实验方法包括qRT-PCR、细胞培养、集落形成和迁移实验。RNA提取使用Trizol试剂，cDNA合成使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，qRT-PCR使用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系统。人膀胱癌细胞系UMUC3和T24来源于中国科学院细胞库，培养于含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中。集落形成实验将1000个转染细胞接种于六孔板，培养2周后甲醇固定，0.1%结晶紫染色，ImageJ软件计数。细胞迁移实验使用Transwell室，细胞悬于150 μL无血清培养基中，下室加入600 μL含10% FBS的培养基，孵育48小时后清除上室细胞，下室细胞用4%多聚甲醛固定和0.1%结晶紫染色，倒置显微镜计数。伤口愈合实验将细胞以4×10⁵个/孔接种于六孔板，达到融合后使用无菌200 μL移液器尖端产生一致划痕，PBS清洗后孵育，于0、24和48小时捕获图像。统计分析使用R语言4.2.0版和GraphPad Prism 10，p值<0.05视为显著。

结果

BLCA中衰老相关基因的识别

p53作为细胞衰老的起始基因，通过调控下游p21触发衰老。细胞衰老通常伴随细胞增殖能力下降，MKI67作为增殖标志物可评估肿瘤细胞增殖活性。研究将p53高表达（高于中位表达水平）和KI67低表达（低于中位表达水平）样本归类为衰老样本，p53低表达和KI67高表达样本归类为非衰老样本。生存分析显示衰老样本生存率显著更高，生存时间及生存/死亡比优于非衰老组，且衰老组高级别BLCA数量显著较低。差异和富集分析表明，两组差异表达基因显著与细胞衰老、细胞周期和p53信号通路相关。

衰老相关基因的聚类分析

研究纳入TCGA-BLCA数据集，发现13个与患者结局显著相关的衰老相关差异表达基因。通过共识聚类将BLCA样本分为两个亚组，显示不同的免疫浸润特征和免疫检查点阻断反应。聚类一致性在K=2时最优，AKAP7、CDCA2、PRPF19、PRR11和STIP1在两组间无显著差异表达，其余衰老基因表达显著不同。

不同聚类与BLCA免疫浸润的相关性分析

CIBERSORT算法分析显示，Cluster 1和Cluster 2在B细胞浆细胞、T细胞CD4+ na?ve、T细胞CD4+记忆静息、T细胞CD4+记忆激活、T滤泡辅助细胞、T调节细胞（Tregs）、静息NK细胞、单核细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、活化髓样树突状细胞和中性粒细胞表达上存在显著差异。免疫检查点相关基因在两组间均显示显著差异。TIDE算法预测Cluster 2对免疫检查点抑制剂（ICB）反应较差，生存率较低，与Cluster 1相比生存率显著更低。

构建诊断和预后模型

结合TCGA-LIHC和GSE13507数据集，诊断模型显示Lasso+Stepglm[forward]算法预测性能最佳，平均AUC为0.976。该预后模型包含七个重要基因：NFIA、TSPAN8、PAQR4、GPC2、CD248、TRIB3和EGR1。预后模型使用RSF算法效果最佳，但平均AUC仅为0.758，包含全部13个基因。

PAQR4作为BLCA细胞衰老的关键调控基因

单变量COX回归分析显示GPC2、PAQR4、TRIB3、TAGLN和CALD1具有显著预后差异，其中GPC2在两个数据集中预后结果冲突，因此确定PAQR4、TRIB3、TAGLN和CALD1为BLCA关键衰老相关预后基因。低表达PAQR4、TRIB3、TAGLN和CALD1的患者对免疫检查点抑制剂反应更好。这些基因与M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、活化CD4记忆T细胞和滤泡辅助T细胞浸润水平呈正相关，与静息树突状细胞、活化树突状细胞、单核细胞、浆细胞、静息肥大细胞和调节T细胞浸润水平呈负相关。

PAQR4在BLCA中的功能分析

按PAQR4中位表达水平分组，差异分析显示314个上调基因和113个下调基因。KEGG分析表明PAQR4在BLCA中与细胞周期、细胞衰老、p53信号通路、花生四烯酸代谢、PPAR信号通路和亚油酸代谢通路显著相关。ssGSEA算法显示PAQR4与肿瘤增殖特征、肿瘤炎症特征、p53通路、凋亡、EMT标志物和血管生成呈正相关。

敲减PAQR4抑制BLCA细胞增殖和转移

qRT-PCR评估显示siPAQR4 #2和#3抑制效果最强。在UMUC3和T24细胞系中，敲减PAQR4显著抑制细胞增殖。划痕实验和Transwell实验表明，敲减PAQR4显著降低细胞迁移和侵袭能力。

讨论

BLCA是一种主要源于膀胱上皮的恶性肿瘤，当前治疗方法包括手术和化疗。尽管治疗策略显著进步，BLCA的5年总生存率约为70%。近年来，免疫疗法成为BLCA有前景的治疗方法，膀胱内免疫疗法被视为高风险高级别BLCA的最佳标准护理，旨在减少或预防复发和疾病进展。但治疗费用高昂，且疗效因患者而异。

细胞衰老在BLCA中扮演复杂角色，影响肿瘤进展和抑制。这一过程以细胞周期不可逆停滞为标志，是限制受损或潜在癌细胞生长的有效机制。在BLCA中，细胞衰老可通过限制致癌突变细胞扩张作为抗肿瘤发生防御机制。然而，细胞衰老与BLCA的相互作用复杂。有研究表明衰老细胞可能发展SASP，促进肿瘤进展和恶性化。SASP以释放多种促炎细胞因子和生长因子为特征，可改变肿瘤微环境，创造促进肿瘤进展的条件。例如，衰老细胞可释放因子吸引免疫细胞，最初可能有助于肿瘤抑制，但持续炎症和邻近非衰老细胞生长激活最终可能导致恶性化。

在BLCA中，衰老细胞积累可导致肿瘤细胞增殖停滞，但若这些细胞持续存在，可能通过SASP创建慢性炎症环境支持肿瘤进展。衰老相关基因表达模式可作为风险分层和预后的潜在生物标志物。研究表明，某些衰老相关基因可用于构建预后模型，提高临床结局预测准确性，指导治疗策略。这些模型证据表明，某些衰老相关通路活性较高的患者总生存率较差。

除肿瘤生长外，细胞衰老还与BLCA免疫反应相关。衰老肿瘤细胞可显著影响免疫景观。一些研究表明非恶性衰老细胞可引发免疫细胞反应，增强免疫监视，但这一反应具情境依赖性，可能导致悖论，即衰老细胞存在可能通过SASP因子调节免疫细胞活性，以有利于肿瘤生长的方式促进肿瘤。

本研究首次报道PAQR4作为BLCA重要衰老基因。既往研究表明PAQR4可能是多种肿瘤的有前景治疗靶点，包括卵巢癌、前列腺癌和肾乳头状细胞癌。我们的结果表明PAQR4可能作为BLCA患者预后指标，敲减其表达可抑制BLCA细胞生长和转移能力。

结论

本研究全面探讨了细胞衰老相关基因在BLCA诊断、预后和免疫治疗中的作用，发现PAQR4作为潜在新型BLCA生物标志物，可能成为临床干预新靶点。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

作者贡献

Yizhang Sun、Xincheng Yi和Chenchao Zhou对本研究贡献相等。Chenchao Zhou和Xincheng Yi共同设计和监督研究。Yizhang Sun、Xincheng Yi和Chenchao Zhou进行和验证生物信息学分析。Yizhang Sun和Chenchao Zhou负责设计实验方案和进行实验。Yizhang Sun和Xincheng Yi准备初稿，Yuhua Huang和Chenchao Zhou修订。所有作者对文章有贡献并批准最终提交版本。

资金

本手稿未接收资金。

致谢

作者感谢所有参与本研究的人员。