表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制NF-κB/Caspase-1信号通路减轻慢性压力诱导的大鼠抑郁样行为

本研究发现绿茶主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）能显著改善慢性不可预知温和应激（CUMS）诱导的雌性大鼠抑郁样行为。研究证实EGCG通过抑制NF-κB/caspase-1细胞焦亡通路，降低IL-1β和IL-18表达水平，从而改善肝细胞焦亡和肝损伤，为抑郁症治疗提供了新的潜在靶点和天然药物选择。

　　

引言

抑郁症是一种以情绪紊乱、思维受损、焦虑和认知/社交功能障碍为特征的慢性精神障碍，被列为全球最紧迫的心理健康问题之一。全球有3.8%的人口（约2.8亿人）患有抑郁症，其中女性患病率比男性高约50%。自COVID-19大流行以来，2020年重度抑郁症新病例数量显著增加（较往年增长27.6%），给患者及其家庭带来沉重的经济和情感负担。尽管临床上报道了抑郁症存在明显的性别差异，但其潜在机制尚不清楚。

慢性应激（如职业或学业压力）是抑郁症的关键风险因素，可诱导持续的炎症反应，促进促炎细胞和细胞因子的释放。过度或长期的压力会过度激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，导致免疫、神经化学和内分泌紊乱等生理功能障碍。作为代谢活动的中心，肝脏对维持合成和分泌功能至关重要，并且对环境压力高度敏感。慢性应激诱导肝脏代谢紊乱和炎症积聚，导致肝损伤，并可能引发肝细胞癌等严重后果，进而加剧抑郁症状。传统中医理论认为，"肝气郁结"由情绪低落或过度心理压力引起，会损害肝功能和脾运输，表现为胸胁痛（肝气郁结）和恶心（脾虚）等症状，表明肝功能障碍与抑郁症之间存在密切联系。

细胞焦亡是一种依赖于caspase-1的程序性细胞死亡新形式，与由IL-1β或IL-18驱动的炎症密切相关。Caspase-1介导的NF-κB激活通路由IL-1分泌触发。Caspase-1作为一种经典的炎症caspase，可通过调节肠道微生物群组成来预防慢性束缚应激（CRS）诱导的抑郁样行为，动物研究表明caspase-1缺失可预防抑郁行为。

目前抑郁症的临床管理主要依赖抗抑郁药，如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）、三环类抗抑郁药（TCAs）、单胺氧化酶抑制剂（MAOIs）和去甲肾上腺素能及特异性5-羟色胺能抗抑郁药（NaSSAs）。然而，这些药物常引起不良反应（如失眠、腹泻、头痛），限制了其临床应用。因此，需要寻找副作用更小的生物活性替代品。绿茶作为消费数千年的广泛饮品，最近被证明能减少小鼠的抑郁样行为。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶的主要成分，具有多种生物活性，包括抗炎、抗纤维化、抗氧化应激、抗凋亡、促进自噬和抗肿瘤作用。研究表明，细胞焦亡在肝损伤中起关键作用，EGCG可减少肝细胞焦亡并通过抑制焦亡相关因子发挥抗抑郁作用。因此，调节细胞焦亡以预防肝损伤可能是改善抑郁症的潜在靶点。

实验材料与方法

实验动物

33只雌性和8只雄性SPF级SD大鼠（6周龄，体重150±10克）购自湖南莱克景达实验动物有限公司。大鼠饲养在温度（25°C±2°C）、湿度（60%±5%）可控且12小时光暗周期的饲养室中，自由获取食物和水。适应1周后开始实验。所有动物程序均经桂林医科大学动物伦理委员会批准（批准号GLMC20243265），并符合现行动物福利指南。

实验方法

模型建立与给药

适应1周后，雌性SD大鼠随机分为三组：对照组（cont，n=9）、应激组（str，n=12）和EGCG干预组（str+EGCG，n=12）。雄性SD大鼠分配到应激组（STR，n=8）。为避免昼夜节律干扰，除对照组外，所有组每天接受两次随机刺激以建立CUMS模型。刺激包括：每日束缚应激（4小时，9:00-13:00）、通宵照明和湿垫料（6小时），持续2周。EGCG（编号HY-13653，纯度99.30%；MCE公司）用生理盐水溶解至50毫克/千克浓度，在每日应激前1小时腹腔注射给str+EGCG组（0.5毫升/100克体重）。对照组和应激组接受等体积无菌0.9%生理盐水。

蔗糖偏好测试（SPT）

快感缺乏是抑郁症的核心症状，表现为对愉悦刺激的反应性降低。SPT在慢性应激第15天进行，遵循4天方案：第1天：自由获取两瓶1%蔗糖溶液。第2天：一瓶1%蔗糖溶液替换为纯水，每12小时交换位置。第3天：禁食禁水。第4天：正式测试：提供一瓶1%蔗糖溶液和一瓶纯水，持续24小时，每12小时交换位置以避免位置偏好。24小时后记录蔗糖溶液和纯水消耗量，蔗糖偏好率计算公式为：蔗糖偏好率（%）=（蔗糖溶液消耗量/（蔗糖溶液消耗量+纯水消耗量））×100%。

强迫游泳测试（FST）

FST又称"行为绝望测试"，评估啮齿动物对不可避免溺水威胁的反应，反映对负面情绪的易感性。不动时间与抑郁样行为呈正相关。将大鼠单独放入透明垂直塑料圆筒（2/3充满25°±1°C水；水深防止接触筒底）。6分钟测试包括2分钟适应期，随后记录剩余4分钟的不动时间（定义为维持头部 above 水面的最小运动）。测试后擦干大鼠放回笼子，更换水用于后续测试。

血清脂质和肝功能指标生化测量

行为测试后，大鼠禁食禁水12小时。用4%戊巴比妥麻醉后，心脏采血，室温静置2小时，4°C下8000转/分钟离心10分钟获得血清，保存于-80°C。使用试剂盒（南京建成生物工程研究所）按照说明书测量血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。510纳米波长读取吸光度，计算浓度。

肝脑组织焦亡相关蛋白Western Blot分析

约0.05克肝或脑组织在预冷蛋白裂解缓冲液中匀浆，超声处理，冰上孵育1小时提取蛋白质。使用BCA试剂盒（P0010，上海碧云天生物技术有限公司）测定蛋白质浓度。30微克总蛋白质经8%-12% SDS-PAGE分离，转印至PVDF膜（Millipore，美国）。膜在室温下用3%脱脂牛奶封闭1小时，然后在4°C下与一抗孵育过夜：NF-κB（Q04206）、caspase-1（P29452）、IL-1β（P01584）、IL-18（P70380）、GAPDH（P04406）、caspase-8（4790S；CST）、caspase-3（ab184787；Abcam）、cleaved-caspase-9（P012889）、cleaved-caspase-8（M011932；Epizyme Biotech）、cleaved-caspase-3（68773-1-Ig）、Bax（50599-2-Ig）、Bcl2（68103-1-Ig；Proteintech）、caspase-9（WL03421）和cleaved-caspase-1（WL03450；万类生物）。随后在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（Anti-Rabbit IgG [H+L]，SA00001-2）孵育1小时。使用Super Signal West Femto化学发光底物（Lee Ji Bio）检测信号，通过自动凝胶成像系统（Protein Simple Inc.，Devens，MA，USA）分析条带灰度值。

统计分析

使用GraphPad Prism 9.5.1软件分析数据，以均值±标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）后Dunnett事后检验或非配对Student t检验比较差异。p值<0.05认为具有统计学显著性。

实验结果

EGCG减轻CUMS诱导的大鼠抑郁样行为

蔗糖偏好降低和FST不动时间增加是大鼠抑郁症的典型症状。经过2周CUMS后，进行SPT和FST评估抑郁样行为。雌性str大鼠的蔗糖偏好显著低于雄性STR大鼠（p<0.01）。与对照组相比，str组的蔗糖偏好显著降低（p<0.01），表明存在快感缺乏，而EGCG干预（50毫克/千克）显著逆转了这种降低（p<0.001）。雌性str大鼠比雄性STR大鼠表现出稍多的活动。str组的不动时间显著长于对照组（p<0.001），表明存在行为绝望，但EGCG干预显著缩短了该时间（p<0.001）。这些结果表明，EGCG能显著减轻CUMS诱导的大鼠抑郁样行为（快感缺乏和行为绝望）。

EGCG改善CUMS诱导的体重减轻和肝指数降低

慢性应激导致大鼠体重增长缓慢和肝指数（肝重/体重）降低。与对照组相比，str组的体重增长显著减少（p<0.01），肝指数显著降低（p<0.05）。EGCG干预显著逆转了体重减轻（p<0.01）和肝指数降低（p<0.05）。这些发现表明EGCG能改善CUMS引起的代谢异常。

EGCG改善CUMS诱导的血脂异常和肝损伤

慢性应激导致血脂异常和肝损伤。str组的血清TG、TC和LDL-C水平显著升高（p<0.05），而HDL-C水平显著降低（p<0.05）。EGCG干预显著逆转了这些变化（p<0.05）。此外，str组的血清ALT和AST水平显著升高（p<0.01），表明肝细胞损伤，而EGCG干预显著降低了这些酶水平（p<0.01）。这些结果表明EGCG能改善CUMS诱导的血脂异常和肝损伤。

EGCG抑制CUMS诱导的肝脑组织NF-κB/caspase-1通路激活和焦亡相关蛋白表达

Western blot分析显示，str组的肝和脑组织中NF-κB、cleaved-caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达显著升高（p<0.01）。EGCG干预显著降低了这些蛋白的表达水平（p<0.01）。此外，str组的caspase-3、caspase-8和caspase-9活化形式（cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8和cleaved-caspase-9）表达增加，促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl2表达下调。EGCG干预显著逆转了这些变化（p<0.05）。这些结果表明EGCG通过抑制NF-κB/caspase-1通路和减少焦亡相关因子表达，减轻CUMS诱导的肝脑组织炎症和细胞死亡。

讨论

本研究证实了EGCG对CUMS诱导的雌性大鼠抑郁样行为的改善作用。研究发现雌性大鼠比雄性大鼠表现出更严重的CUMS诱导抑郁样行为，与流行病学数据一致，表明女性对抑郁症更易感。EGCG治疗逆转了CUMS诱导的蔗糖偏好降低和FST不动时间增加，表明其抗抑郁作用。

机制上，EGCG通过抑制NF-κB/caspase-1细胞焦亡通路，降低IL-1β和IL-18表达，从而改善肝细胞焦亡和肝损伤。慢性应激激活NF-κB通路，促进caspase-1活化，导致细胞焦亡和炎症因子释放。EGCG作为天然化合物，能有效抑制这一通路，减少炎症反应和组织损伤。

此外，EGCG改善了CUMS诱导的代谢异常，包括体重减轻、肝指数降低、血脂异常和肝损伤。这些发现强调了肝脑轴在抑郁症中的重要性，以及通过保护肝脏功能来缓解抑郁症状的潜在策略。

结论

EGCG能缓解CUMS诱导的雌性大鼠抑郁样行为（快感缺乏和行为绝望）。这种保护作用可能通过抑制NF-κB/caspase-1细胞焦亡通路，减少IL-1β和IL-18表达，从而改善肝细胞焦亡和减轻肝损伤来实现。研究结果为抑郁症治疗提供了新的见解，表明EGCG作为天然化合物具有潜在抗抑郁应用价值。未来研究应进一步探索EGCG在临床中的应用潜力及其详细分子机制。