原花青素纳米脂质体冻干粉通过Keap1/Nrf2通路调控氧化应激和炎症反应对乳糜泻细胞模型的保护作用及机制研究

本研究创新性开发原花青素纳米脂质体冻干粉（PCNL-FD）递送系统，通过4%海藻糖作为冻干保护剂显著提高稳定性，证实其通过激活Keap1/Nrf2信号通路上调NQO-1/HO-1表达，有效清除DPPH/ABTS/羟基自由基，在p31-43诱导的乳糜泻（CD）Caco-2细胞模型中显著降低ROS/MDA水平并提升GSH/SOD/CAT活性，同步抑制促炎因子（TNF-α/IL-6）和促进抗炎因子（IL-4/IL-10）表达，为炎症性肠病抗氧化治疗提供新策略。

　　

3.1 冻干保护剂对原花青素纳米脂质体的影响

冻干保护剂的筛选对维持纳米脂质体稳定性具有关键意义。研究通过比较海藻糖和甘露醇不同浓度（2%-10%）的保护效果，发现未添加保护剂的冻干样品呈现浅黄色且存在明显皱缩裂纹，复溶后粒径增大至274.985 nm，PDI升至0.390，ζ电位降至-9.600 mV，包封率显著降低至39.619%。而添加4%海藻糖时，PCNL-FD呈现乳白色光滑结构，粒径保持182.713 nm，PDI为0.225，ζ电位达-18.700 mV，包封率高达91.917%，显著优于同等浓度甘露醇组（粒径324.358 nm）。这种浓度依赖性效应源于冻干过程中水分流失导致的颗粒融合，以及复水时双层膜扩张引起的粒径变化。基于增强渗透滞留效应（EPR）对30-200 nm纳米颗粒的偏好性，最终选择4%海藻糖作为最优冻干保护剂。

3.2 PCNL-FD的结构表征

透射电镜（TEM）分析显示PCNL-FD呈椭球形且表面光滑，粒径分布均匀，但存在制备过程中脂质双层融合导致的聚集现象。傅里叶变换红外光谱（FTIR）进一步证实了纳米结构的成功构建：BNLF在3300 cm^-1处出现O-H伸缩振动峰，2927 cm^-1和2867 cm^-1为C-H不对称/对称伸缩振动特征峰，1736 cm^-1（C=O）、1145 cm^-1（PO₂）和1039 cm^-1（P-O-C）则对应磷脂特征基团。原花青素（PC）的典型峰位于3397 cm^-1（酚羟基氢键）、1613 cm^-1（多黄酮特征基团）及1285 cm^-1（黄酮类单宁），而PCNL-FD光谱与BNLF高度相似且PC特征峰显著减弱，证明原花青素已成功嵌入磷脂双层。

3.3 体外抗氧化评价与模拟消化

通过DPPH、ABTS和羟基自由基清除实验评估抗氧化活性，发现PCNL-FD的半数抑制浓度（IC₅₀）显著优于游离原花青素：DPPH清除IC₅₀分别为0.1515 μg/mL（PCNL-FD） vs 3.779 μg/mL（PC）；ABTS清除IC₅₀为7.327 μg/mL vs 10.85 μg/mL；羟基自由基清除IC₅₀为7.340 μg/mL vs 15.86 μg/mL。模拟消化实验显示，PCNL-FD在口腔阶段（pH 6.8±0.2, 10 min）、胃阶段（pH 2-3, 2 h）和肠阶段（pH 7.0, 2 h）均能维持较高稳定性，其释放率计算公式为R(%)=[1-(EE_t/EE₀)]×100% 和 R₁(%)=[1-(A_t/A₀)]×100%，其中EE_t和EE₀分别代表不同时间点包封率和初始包封率，A_t和A₀为相应吸光度值。

2.6 细胞培养与乳糜泻模型建立

采用人结肠腺癌细胞系Caco-2构建乳糜泻（CD）模型，细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）及1%青霉素/链霉素的DMEM/F-12培养基中。通过p31-43肽段（100 μg/mL, 24 h）诱导建立CD模型，实验分为五组：正常对照组（CK）、CD模型组、空白纳米脂质体预处理组（BNLF+CD）、游离原花青素预处理组（PC+CD）及PCNL-FD预处理组（PCNL-FD+CD）。预处理浓度均为20 μg/mL，时间12 h。

2.7 PCNL-FD对CD模型氧化应激的干预

细胞活性检测显示PCNL-FD预处理显著提升p31-43诱导后的细胞存活率。氧化应激指标测定发现：PCNL-FD组超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（CAT）活性显著升高，而丙二醛（MDA）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平明显降低。DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧（ROS）显示，PCNL-FD组平均荧光强度显著减弱。炎症因子检测表明：PCNL-FD有效抑制促炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）分泌，同时促进抗炎因子IL-4和IL-10表达。

2.7.4 Keap1/Nrf2信号通路的蛋白印迹分析

Western blot结果显示：PCNL-FD干预显著下调Keap1蛋白表达，激活核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路，进而上调醌氧化还原酶1（NQO-1）和血红素氧合酶1（HO-1）的表达。该机制阐明PCNL-FD通过调控Keap1/Nrf2/HO-1/NQO-1信号轴增强细胞内源性抗氧化防御系统。

3 结果与讨论

综合结果表明，PCNL-FD通过纳米脂质体包封技术有效克服了原花青素稳定性差和生物利用度低的局限。4%海藻糖作为冻干保护剂可最优维持纳米颗粒的结构完整性和功能活性。在p31-43诱导的乳糜泻细胞模型中，PCNL-FD通过激活Keap1/Nrf2信号通路协同发挥抗氧化和抗炎作用，不仅清除DPPH、ABTS和羟基自由基，还调节GSH/GSSG redox平衡，降低脂质过氧化产物MDA，并平衡促炎/抗炎细胞因子网络，为炎症性肠病的纳米靶向治疗提供了实验依据和理论支撑。