恒定血清浓度策略突破AAV中和抗体检测中的基质效应难题，提升基因治疗疗效评估精准度

本研究针对AAV基因治疗中传统中和抗体(NAb)检测方法因血清浓度变化导致的基质效应，开发了恒定血清浓度(CSC)检测技术。该研究通过多血清型测试证实，CSC方法可重新分类21.7%传统方法漏检的阳性样本，显著提升检测灵敏度，并在临床前模型中延长血清阳性检出时间达一年，为基因治疗再给药策略和患者分层提供了关键技术支持。

　　

腺相关病毒(AAV)载体已成为现代基因治疗的基石，成功应用于脊髓性肌萎缩症、血友病和视网膜营养不良等遗传性疾病的治疗。然而，针对AAV衣壳的预存中和抗体(NAb)仍是重大挑战——根据不同血清型和地区差异，阳性率高达40%-70%。这些抗体通过阻断病毒转导显著影响治疗效果。

传统细胞转导抑制试验存在显著局限：采用可变血清浓度(VSC)方法时，不同稀释度的血清总含量变化会人为抬高转导基线，掩盖部分中和现象。这种基质效应导致灵敏度下降，可能错误分类血清阳性样本，进而影响患者分层和治疗方案制定。

为攻克这一技术瓶颈，Beatrix Kovács等研究团队在《Gene Therapy》发表了创新性研究方法。他们开发了恒定血清浓度(CSC)检测技术，通过将测试血清与血清阴性稀释剂平衡，使所有稀释度保持固定血清浓度，从而稳定检测基线并显著提升中和抗体检测灵敏度。

研究团队通过多技术路线验证方法效能：采用人源血清样本（46例捐赠者）和多物种样本（猫6例、恒河猴2例）；运用AAV1/5/9三种血清型；通过qPCR测定病毒基因组滴度；建立VSC与CSC平行对比实验体系；采用贝叶斯等效性检验进行统计学分析。关键技术包括：保持10%恒定血清浓度、血清与AAV预孵育优化、NLuc荧光素酶报告基因检测系统，以及线性模型计算50%中和滴度(ND₅₀)。

Assay sensitivity strongly depends on pre-incubation conditions

研究发现血清成分对AAV转导具有双重作用：当血清与病毒颗粒预孵育时显著增强转导效率，而直接加入细胞培养基时则抑制转导。这种浓度依赖性效应在VSC方法中导致稀释度增加时转导基线人为升高，而CSC方法通过恒定血清浓度消除了此干扰，使非中和样本曲线稳定在100%附近。

Increased sensitivity of the CSC assay offers robust stratification of seronegative and seropositive samples

在46例人血清测试中，CSC方法对AAV1/5/9的血清阴性样本鉴定均比VSC更严格，不一致率分别达30.4%、47.8%和41.3%。使用50%转导抑制标准时，CSC重新分类了4.3%-21.7%的样本，证明其能更准确区分低水平中和抗体。

Improved performance of the CSC assay generalizes across species

在猫和恒河猴模型中，CSC同样表现出稳定的基线性能，跨物种一致性表明该方法在临床前研究中具有广泛适用性，为转化医学研究提供了可靠技术平台。

Seroreversion models demonstrate the utility of the CSC assay in determining neutralizing antibody persistence

纵向研究显示，在猫疫苗接种模型中，CSC在接种后4个月仍检测到中和活性(ND₅₀≈1/8)，而VSC已显示血清转阴。在AAV注射模型中，CSC在注射后三年仍检测到CAP-B22中和抗体，而VSC在第三年已无中和现象。针对亲本AAV9衣壳的中和活性下降更早，表明衣壳特异性免疫对再给药策略具有重要影响。

该研究的核心结论表明，CSC方法通过消除血清浓度变化引起的基质效应，显著提高了AAV中和抗体检测的灵敏度和可靠性。这种方法不仅改善了患者分层准确性，还为血清逆转时间点的判定提供了更精确的依据，对基因治疗中的再给药策略制定具有重要临床意义。

研究发现，即使低水平中和抗体也能显著影响基因治疗效果，这使得CSC方法检测低滴度抗体的能力显得尤为重要。该方法在多物种中表现一致，支持其作为跨临床前和临床研究标准化平台的潜力。未来研究需在更大队列中验证临床相关性，并探索该方法在其他病毒中和抗体检测中的适用性。

这项工作通过巧妙改进实验设计解决了长期存在的技术难题，为AAV基因治疗的免疫监测提供了更可靠的工具，最终有望优化治疗策略并扩大受益患者群体。