CRISPR/Cas9工程化NURR1报告基因诱导神经干细胞通过异步共培养增强神经元分化

本研究针对帕金森病细胞治疗中神经元分化效率低、移植存活率差及实时监测手段缺乏等难题，开发了基于NURR1-ZsGreen报告系统的iNSC模型，结合异步共培养策略显著提升多巴胺能神经元分化效率，为神经再生治疗提供新型技术平台。

　　

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）作为一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征是中脑多巴胺能神经元的渐进性丧失，导致患者出现震颤、运动迟缓等典型症状。尽管现有治疗方法如多巴胺能药物和脑深部电刺激能够暂时缓解症状，却无法阻止疾病的持续进展。近年来，干细胞移植治疗为帕金森病带来了新的希望，通过将诱导多能干细胞（iPSCs）、胚胎干细胞（ESCs）或神经干细胞（NSCs）分化为多巴胺能前体细胞并移植至患者脑内，有望实现神经环路的重建和功能恢复。然而，这一策略仍面临诸多挑战：细胞分化过程中的异质性、移植后存活率低、整合效率不佳，以及缺乏实时、动态监测分化进程的有效手段。

为了解决上述问题，研究团队在既往研究基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了NURR1（Nuclear receptor-related factor 1）驱动的ZsGreen荧光报告基因诱导神经干细胞（iNSCs）模型，旨在实时追踪多巴胺能神经元的分化过程。此外，团队还创新性地提出“异步共培养”策略，将不同分化阶段的细胞共同培养，模拟体内发育的时空动态微环境，显著提升了分化效率和细胞纯度。该研究发表于《Journal of Neurorestoratology》，为帕金森病的细胞治疗提供了重要的技术突破和理论支持。

在研究过程中，作者主要采用了以下几项关键技术：利用CRISPR/Cas9在NURR1基因终止密码子前精准插入T2A-ZsGreen报告单元；通过荧光激活细胞分选术（FACS）分离ZsGreen阳性与阴性群体并进行转录组测序（RNA-seq）；建立异步共培养系统，将分化第5天（早期）与第8天（中期）的iNSCs以1:7比例共培养；使用免疫荧光染色、qPCR等技术评估多巴胺能标志物表达；最后将优化后的多巴胺能前体细胞移植至SCID-Beige小鼠纹状体，评估其存活与分化情况。

3.1. CRISPR/Cas9-Mediated In-Frame Knock-In of a T2A-ZsGreen Cassette into the hNURR1 Locus in Induced Neural Stem Cells

研究人员通过CRISPR/Cas9技术成功在NURR1基因位点敲入T2A-ZsGreen报告单元，经基因组PCR验证插入正确性，核型分析显示工程化iNSCs保持正常染色体结构（46, XY），免疫荧光证实其高表达SOX1、SOX2、PAX6等神经干细胞标志物，而未检测到多能性标志物OCT4，表明细胞在基因编辑后仍维持神经干细胞的特性。

3.2. Dopaminergic Reporter iNSCs Exhibit Multilineage Neural Differentiation Potential

体外自发分化实验证明，该报告基因iNSCs具有多向分化潜能，可分化为神经元（表达TUJ1、MAP2、NEUN）和星形胶质细胞（表达S100B），说明其作为多能神经前体细胞的特性未因基因编辑而改变。

3.3. In vitro Differentiation of Dopaminergic Neurons from iNSCs

通过两阶段分化方案，iNSCs成功分化为表达LMX1A、FOXA2与TH的多巴胺能神经元。定量分析显示约20–30%的细胞表达ZsGreen，其中80%的ZsGreen+细胞共表达FOXA2。qPCR结果进一步证实，随着分化进行，LMX1A、TH、NURR1等标志基因表达显著上调。

3.4. RNA Sequencing Analysis for Dissecting Heterogeneity in Dopaminergic Differentiation

通过FACS分选ZsGreen+与ZsGreen–细胞并进行RNA-seq分析，发现两组之间存在显著转录差异：ZsGreen+群体中1468个基因上调、899个基因下调，富集于轴突导向、突触传递、神经元投射等神经发育相关通路。这表明ZsGreen阳性群体更倾向于神经分化方向，而阴性群体则包含更多未分化或限制性前体细胞。

3.5. Asynchronous Co-Culture Enhances Dopaminergic Lineage Commitment

研究人员将分化第5天与第8天的细胞以1:7比例进行异步共培养。流式细胞术与活细胞成像显示，共培养组ZsGreen荧光强度显著高于对照组。qPCR分析进一步表明，共培养条件下LMX1A、FOXA2、NURR1、TH等基因表达显著上升，说明该策略有效促进了多巴胺能谱系分化。

3.6. In vivo Differentiation of Dopaminergic Reporter iNSCs into Functional Neurons

将异步共培养优化后的多巴胺能前体细胞移植至小鼠纹状体，8周后免疫荧光检测发现移植细胞存活良好，并分化为TH阳性神经元，ZsGreen信号与TH共定位，证实其在体内仍保持多巴胺能分化潜能。

研究结论与讨论部分指出，NURR1-ZsGreen报告系统不仅实现了多巴胺能分化的实时动态监测，还为解析分化异质性提供了分子基础。异步共培养策略通过模拟发育过程中的时空信号交互，显著提升分化效率与细胞纯度，解决了传统分化方法产量低、异质性高的难题。该研究建立的技术平台兼具监测与优化功能，有望推动帕金森病细胞治疗向临床转化。尽管研究已证实其体内外有效性，作者也指出未来需进一步优化培养体系、引入三维培养或类器官模型，并在更大型的帕金森病动物模型中开展行为学与电生理功能验证，最终实现符合GMP标准的生产工艺，为临床应用提供可靠、安全的细胞治疗产品。