基于干细胞工具包模拟父源15号染色体单亲二体所致Angelman综合征的研究

为填补Angelman综合征(AS)中由父源15号染色体单亲二体(patUPD15)所致罕见亚型的研究空白，研究人员利用非整合性仙台病毒重编程技术，从患者及家族匹配对照成功构建三对诱导多能干细胞(iPSC)系。这些细胞系经严格质控证实具有多能性、三胚层分化潜能及正确的遗传/表观遗传完整性，为探索patUPD15特异性分子机制及个体化治疗开发提供了关键平台。

　　

Angelman综合征是一种罕见的神经发育障碍，患者常表现为严重发育迟缓、语言障碍、共济失调、癫痫发作以及异常愉悦兴奋的行为特征。该疾病主要由母源遗传的UBE3A基因功能缺失引起，该基因位于15号染色体q11-q13区域(15q11-q13)。有趣的是，UBE3A基因在大脑神经元中呈现一种特殊的组织特异性基因组印记现象——只有母源等位基因表达，而父源等位基因则被UBE3A反义转录本(UBE3A-ATS)沉默。当母源UBE3A失去功能时，父源等位基因无法补偿，从而导致疾病发生。

Angelman综合征的分子机制多样，主要包括母源15q11-q13大片段的缺失、母源UBE3A基因突变、印记缺陷以及父源15号染色体单亲二体(patUPD15)。其中，patUPD15是最为罕见且研究最为不足的亚型，约占总病例的3%–5%。这类患者不仅完全缺失母源UBE3A，还因携带两条父源染色体而异常高表达多个父源印记基因（如MKRN3、MAGEL2、NDN等），其独特的分子背景可能影响临床表现和治疗策略。然而，由于缺乏合适的疾病模型，patUPD15的病理机制和潜在疗法一直难以深入探索。

以往研究多依赖于母源UBE3A敲除的小鼠模型，但这些模型表型较轻，且无法模拟patUPD15等遗传背景。近年来，人多能干细胞技术为疾病建模带来了新机遇。患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)不仅保留疾病原有的遗传和表观遗传特征，还可分化为神经元或脑类器官，从而在体外模拟疾病过程。遗憾的是，此前全球仅报道了一株patUPD15来源的iPSC系，且缺乏遗传匹配的对照细胞系，严重限制了研究的可靠性和转化价值。

为此，研究团队在本文中成功建立了三对patUPD15 Angelman综合征患者及其家族性别匹配对照的iPSC系，为这一罕见亚型的研究提供了迄今最全面的干细胞工具包。

本研究采用的主要技术方法包括：从三组patUPD15患者及对照家属采集外周血单核细胞(PBMCs)，使用非整合性仙台病毒载体递送Yamanaka因子（OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC）进行重编程；通过RT-qPCR、免疫荧光、流式细胞术评估多能性标志物；利用三胚层分化试剂盒结合RT-qPCR与免疫荧光验证分化潜能；通过短串联重复序列(STR)分析验证细胞系身份与克隆性；G带核型分析与qPCR遗传分析检测染色体稳定性；联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析(COBRA)检测印记控制区(PWS-IC)甲基化状态。

研究结果：

Stemness, pluripotency and identity of newly generated induced pluripotent stem cells：

研究人员通过RT-qPCR证实所有iPSC系均清除仙台病毒基因组，高表达多能性基因POU5F1（OCT4）和NANOG。免疫荧光显示细胞核表达OCT4和SOX2蛋白，流式细胞术证实>95%的细胞表达表面标志物TRA-1-60和SSEA4。三胚层分化实验进一步证明这些细胞可高效分化为中胚层（高表达TBXT/BRACHYURY）、内胚层（表达SOX17）和外胚层（表达PAX6与NESTIN），证实其多能性。STR分析显示iPSC与来源PBMC样本完全匹配，证明细胞系克隆性和来源正确。

Genetic and epigenetic fidelity of newly generated induced pluripotent stem cells：

核型分析显示所有细胞系染色体数目与结构正常，未发现与patUPD15相关的罗伯逊易位等异常。qPCR遗传分析检测1q、8q、10p、12p、17q、20q11.21、Xp增益和18q缺失等iPSC常见变异，结果无显著异常，表明细胞遗传稳定性良好。利用COBRA方法分析PWS-IC甲基化状态，发现对照组细胞同时存在甲基化（母源）与非甲基化（父源）条带，而patUPD15组仅显示非甲基化条带，与预期父源表观遗传状态一致，且重编程过程未引发该印记区域的不稳定。

Conclusion：

本研究成功构建并系统鉴定了三对patUPD15 Angelman综合征患者与家族对照的iPSC系。这些细胞系具有正常核型、多能性、三胚层分化能力以及正确的印记状态，可作为研究patUPD15分子机制的可靠体外模型。该工具包填补了该疾病亚型研究模型的空白，为理解UBE3A功能缺失背景下父源印记基因异常表达的综合效应提供了独特平台。此外，这些细胞系可用于评估靶向UBE3A-转录本的反义寡核苷酸(ASO)等治疗策略在patUPD15背景下的可行性与安全性，避免潜在UBE3A过表达风险，推动Angelman综合征个体化治疗的发展。