沙利度胺靶向CCL2介导细胞衰老：狼疮肾炎治疗新机制与精准干预策略

本综述系统性整合转录组学与计算生物学方法，首次揭示狼疮肾炎（LN）中60个细胞衰老相关差异表达基因（CS-DEGs）通过病毒应答、NOD样受体信号通路和脂质代谢途径驱动疾病进展。研究发现CCL2/JAK2/FOS/JUN构成核心调控网络，分子对接证实沙利度胺与CCL2具有超高结合亲和力（ΔG=?92.7?kcal/mol），为LN的靶向治疗提供新策略。

　　

引言

系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，全球约340万患者，90%为女性，其中40%会发展为狼疮肾炎（LN）。LN是终末期肾病（ESRD）的主要风险因素，约20%患者在诊断十年内进展为ESRD。尽管糖皮质激素和环磷酰胺等免疫抑制剂改善了生存率，但30-40%患者仍因治疗抵抗或疾病复发进展至肾衰竭。当前疗法在靶向LN核心分子机制方面存在局限，特别是免疫微环境与细胞网络间的动态交互。新兴研究强调识别疾病特异性分子靶点的重要性，其中细胞衰老作为慢性炎症与器官纤维化的关键链接，为LN发病机制和治疗创新提供了新视角。

LN发病机制高度异质，涉及遗传易感性（如HLA-DR3等位基因）、环境触发（如紫外线诱导DNA损伤）和免疫失调（如异常I型干扰素（IFN）信号）的多层次相互作用。LN进展的关键因素是肾脏免疫微环境失调，以CD4+ T细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs）异常浸润为特征，这些细胞促进自身抗体沉积、补体激活和促炎细胞因子（如IFN-α、IL-6）分泌，启动肾小球和肾间质的炎症级联。多组学研究已识别出LN肾活检中的组织特异性生物标志物，如肾小球富集基因（ALOX5、PTGER2、PRKCB）。值得注意的是，LN患者血液和肾组织中干扰素刺激基因（ISGs）的持续上调与疾病活动度强烈相关，表明过度活跃的IFN信号是肾损伤的核心分子驱动因素。然而，传统免疫抑制疗法在调节IFN通路和预防慢性炎症诱导的细胞衰老方面效果有限，这是LN治疗失败的关键因素。

细胞衰老已成为LN发病机制的焦点。衰老细胞通过p16^INK4a/p21通路介导不可逆细胞周期停滞，并分泌衰老相关分泌表型（SASP）因子，包括IL-6、CCL2和TGF-β，从而促进促炎和促纤维化微环境。生理条件下，巨噬细胞通过CX3CR1依赖性吞噬有效清除衰老细胞；但在LN的慢性炎症环境中，巨噬细胞功能障碍导致衰老细胞积累，通过SASP机制加剧肾脏炎症和纤维化。临床研究表明，肾小管上皮细胞中p16^INK4a表达与小鼠LN模型中蛋白尿严重程度和间质纤维化程度强烈相关，提示p16^INK4a可能作为LN疾病进展的潜在生物标志物。临床前研究强调ABT-263等药物通过选择性诱导衰老细胞凋亡，显著减轻LN动物模型肾损伤，减少SASP介导的炎症和纤维化。然而，衰老相关枢纽基因的系统识别、功能验证及其与LN免疫浸润的相互作用仍待探索。

多组学技术的进步深刻改变了对LN分子网络的解析。转录组、表观组和蛋白质组数据集的整合 enable 系统性识别差异表达基因（DEGs）和构建功能互作网络，从而促进驱动疾病进展的关键通路识别。作为关键SASP因子，CCL2在招募单核细胞到炎症部位中起关键作用，加剧肾损伤。同时，JAK2作为JAK-STAT信号通路的核心激酶，可能介导干扰素信号与细胞衰老之间的串扰。然而，这些基因是否作为LN中衰老驱动微环境的枢纽节点，以及它们的靶向调控如何影响疾病轨迹，仍需通过生物信息学与实验方法的整合进一步阐明。

沙利度胺作为一种免疫调节剂，因其抑制TNF-α产生和调节T细胞分化的能力，被研究用于治疗难治性SLE。Schafer等证明沙利度胺靶向CRBN，导致SLE患者中转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）降解，贡献其免疫调节效应。新研究证明其通过抑制NF-κB信号减少SASP因子分泌，同时增强巨噬细胞介导的衰老细胞清除。这些发现表明其双重治疗机制——免疫调节和抗衰老效应——可能有助于SLE中的肾脏保护。然而，关于沙利度胺靶向LN中衰老相关枢纽基因（如CCL2和JAK2）的能力，及其精确分子相互作用和临床疗效，仍存在重大知识空白。

应对这些科学挑战，本研究开创性整合生物信息学、计算药理学和分子动力学模拟，实现三个主要目标：通过多队列转录组分析（GSE61635、GSE121239）识别LN DEGs，随后通过交叉引用细胞衰老数据库（CellAge）系统表征免疫浸润相关枢纽基因；利用分层网络构建和功能模块分析阐明LN衰老微环境中的分子串扰机制；采用集成对接策略和MM/GBSA自由能计算全面评估沙利度胺与优先靶点（CCL2、JUN、JAK2、FOS）的结合亲和力，辅以增强采样分子动力学模拟以细化药物-靶点复合物稳定性谱。

材料与方法

数据集获取与预处理

研究利用基因表达综合（GEO）数据库系统识别LN相关数据集。选择两个合适数据集：GSE61635（99例LN患者和30例健康对照）和GSE121239（292例LN患者和20例健康对照），分别来自外周血样本，累计441样本（391例LN组和50例对照组）。

数据协调与差异表达基因识别

使用Affymetrix平台探针注释文件将探针ID映射至标准化基因符号。多探针关联基因取算术平均确定最终基因表达水平。使用sva包ComBat算法校正批次效应，PCA评估校正效果。随后使用limma包进行差异表达分析，筛选标准|log₂FC| > 0.5且FDR < 0.05。最终使用ggplot2包生成火山图可视化DEGs分布。

CS-DEGs识别

从CellAge数据库检索866个实验验证的细胞衰老相关基因。使用VennDiagram包确定DEGs与CellAge基因集交集以筛选LN特异性CS-DEGs。Fisher精确检验评估CS-DEGs富集显著性，阈值p < 0.05。

功能与通路富集分析

使用clusterProfiler和DOSE包对CS-DEGs进行多层次功能注释：GO分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC），选择P值最低的前10个GO术语；KEGG通路富集分析旨在阐明关键信号网络组成与机制，选择前30个通路按P值升序排列。GSEA探索LN组与对照组间通路活性差异，使用MSigDB数据库参考基因集"c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt"，选择FDR值最低的前5个通路。

PPI网络构建与枢纽基因识别

CS-DEGs上传至STRING数据库，最小互作置信度>0.7，排除孤立节点构建PPI网络。随后使用Cytoscape软件可视化和分析PPI网络拓扑属性。MCODE插件识别网络中密集互连子模块，参数设置：degree cutoff = 2, k-core = 2, max depth = 100。为筛选枢纽基因，应用CytoHubba插件提供的十种不同拓扑算法（包括MCC、DMNC、MNC、Degree、BottleNeck、Eccentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress）。最终识别六个关键CS-DEGs作为核心基因。使用GeneMANIA平台探索这些枢纽基因的共表达关系。

ceRNA调控网络构建

为探索核心基因通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制控制下游靶基因的调控网络，本研究采用多源整合策略：首先整合计算预测数据库（miRanda、miRDB、TargetScan）和实验验证数据（miRTarBase）识别与核心基因相关的高置信度miRNA互作对；其次使用spongeScan数据库预测这些miRNA的潜在lncRNA结合伙伴，建立功能相关miRNA-lncRNA调控对；最后使用Cytoscape软件整合mRNA-miRNA-lncRNA三元互作构建全面ceRNA调控网络，系统揭示核心基因在此网络中的功能枢纽作用。

转录因子靶基因调控网络构建与分析

为系统阐明枢纽基因的转录调控机制，本研究利用TRRUST数据库构建转录因子-靶基因调控网络。应用严格筛选标准（如染色质免疫沉淀测序和报告基因 assay 等直接调控证据）提取与核心基因相关的转录因子及其靶基因互作数据。同时检查转录因子间的层级调控关系。所有分析使用数据库提供的保守预测模型，置信度阈值p < 0.05以确保网络拓扑的生物可靠性和稳健性。

药物-靶点相互作用预测与分子对接验证

本研究采用基于系统药理学的反向筛选策略从DSigDB数据库提取实验验证的药物-基因互作数据。使用R中"clusterProfiler"包对LN相关枢纽基因（CCL2、JUN、FOS、JAK2）进行药物富集分析，显著性阈值FDR < 0.05以识别与LN病理机制显著相关的候选药物。随后利用STRINGdb包构建药物-靶点互作网络，基于拓扑特征（节点度≥5、介数中心性≥0.1）确定关键调控药物。为验证这些候选药物的结合亲和力，从PubChem数据库检索其3D结构，从RCSB PDB数据库下载枢纽基因对应蛋白的晶体结构。使用PyMOL预处理蛋白结构。最后使用CB-Dock2平台进行全蛋白表面盲对接分析，筛选标准结合自由能（ΔG）≤ ?7.0?kcal/mol且至少三个氢键，以评估药物-靶点复合物的结合稳定性和构象合理性。

统计分析

连续变量正态性使用Shapiro–Wilk检验评估。组间比较，数据正态分布时应用独立样本t检验；否则使用Mann-Whitney U检验。多组差异检查使用单因素方差分析（ANOVA），随后Tukey事后检验 pinpoint 具体显著差异来源。所有统计分析使用R软件（v4.1.2）和SPSS软件（v27.0），双侧显著性水平 set at p < 0.05。

结果

数据预处理与DEGs筛选

本研究整合两个GEO数据库转录组数据集：GSE61635（99例LN病例和30例对照）和GSE121239（292例LN病例和20例对照）。为处理批次效应，使用sva包ComBat算法校正。PCA显示校正前两个数据集在PCA空间显著分离，校正后样本分布表现出更大重叠，表明成功消除批次效应。随后合并校正数据集，使用limma包进行差异表达分析。筛选标准|log₂FC| > 0.5且FDR < 0.05，识别1098个DEGs，其中555个上调和543个下调。火山图可视化DEGs分布特征，x轴表示logFC，y轴表示?log₁₀(adj.P.Val)。红点表示显著上调基因，蓝点表示显著下调基因。基于CellAge数据库记录的866个细胞衰老相关基因，使用VennDiagram包与DEGs进行交集分析，识别60个LN特异性CS-DEGs。

CS-DEGs功能表征

基于60个CS-DEGs的功能注释分析，识别以下关键发现：GO分析中，BP显著富集于病毒应答、髓系细胞分化和抗病毒防御应答，表明这些DEGs可能通过调节宿主抗病毒免疫应答和免疫细胞分化 contribute to LN进展。CC主要定位于黏着斑和细胞-基质连接，表明细胞黏附与微环境相互作用可能在疾病表型塑造中起关键作用。MF主要集中于DNA结合转录因子活性，暗示转录因子活性调节可能影响LN发病机制。KEGG通路富集分析显示DEGs显著关联脂质代谢与动脉粥样硬化、NOD样受体信号通路和流感A，表明失调的脂质代谢、天然免疫炎症激活和病毒-宿主相互作用可能共同 contribute to LN病理过程。GSEA进一步证实功能水平上，"负调控病毒基因组复制"术语在治疗组显著富集，与GO分析发现一致，支持宿主直接抑制病毒复制能力与LN发病密切相关的假设，可能通过病毒触发自身免疫或干扰素通路异常激活等机制。通路水平上，NOD样受体信号通路富集突出其介导LN相关肾损伤、炎症应答和疾病进展关键过程的潜在作用，这些过程包括炎症小体激活（如NLRP3）、促炎细胞因子释放（IL-1β、IL-18）和与I型干扰素通路的相互作用。

PPI网络构建与模块分析

进一步使用STRING数据库构建PPI网络，识别50个CS-DEGs，包括25个上调基因（红色高亮）和25个下调基因（绿色高亮）。随后通过Cytoscape软件MCODE插件识别高密度子模块，包含7个上调基因和3个下调基因。此外通过整合CytoHubba插件提供的9种拓扑分析算法，最终选择6个枢纽基因作为核心CS-DEGs。基于GeneMANIA数据库的共表达网络分析显示这些枢纽基因功能主要富集于STAT介导的受体信号通路、干扰素-γ应答调节、细胞氧化应激应答、镉离子应答和干扰素-γ介导的信号通路。这些发现与先前GO、KEGG和GSEA分析高度一致。例如STAT信号通路与干扰素-γ调节密切相关并直接参与抗病毒免疫、炎症小体激活和自身抗体产生。氧化应激和镉离子应答表明环境有毒物质（如镉）可能通过诱导氧化损伤加剧LN中免疫失衡。干扰素-γ信号和NOD信号通路协同驱动Th1型免疫应答，从而促进LN患者肾组织炎症应答和纤维化。总之，枢纽基因通过整合免疫信号转导、环境应激应答和炎症级联，在LN免疫失调和靶器官损伤中起关键调控作用。

ceRNA调控网络与核心基因和转录因子互作调控网络构建

基于多个miRNA靶基因数据库（miRanda、miRDB、TargetScan和实验验证数据库miRTarBase）联合筛选，识别四个枢纽基因（CCL2、JUN、FOS、JAK2）。这些基因在所有四个前述数据库中表现出一致的高置信度miRNA互作对。使用spongeScan数据库预测9个miRNA（包括hsa-miR-1-3p、hsa-miR-338-3p等）的潜在lncRNA结合分子，建立miRNA-lncRNA调控对。通过进一步整合mRNA-miRNA-lncRNA三元互作关系，使用Cytoscape软件建立ceRNA调控网络。网络拓扑分析显示枢纽基因表现出显著特征，表明其与lncRNAs竞争结合miRNAs。例如FOS和ZNF833P被识别为竞争hsa-miR-181a-5p。此外基于TRRUST数据库建立枢纽基因-转录因子调控网络，识别11个关键转录因子，包括SP1、ARNT和ESR2。值得注意的是FOS与SP1、ARNT等形成多维调控轴。Cytoscape中MCODE模块分析证明此互作簇显著富集于JAK-STAT信号通路，进一步突出其在LN免疫失调中的级联调控作用。

独立队列中枢纽基因验证

为进一步验证研究发现稳健性，分析一个独立外部转录组数据集：GSE112943（包括14例LN病例和7例对照，源自肾脏样本）。使用limma包进行差异表达分析。结果 yield 优先枢纽基因的以下差异表达结果：CCL2显著上调（log₂FC=3.97，调整p=4.11e?4），JUN显著下调（log₂FC=?1.89，调整p=3.85e?7），JAK2显著上调（log₂FC=1.67，调整p=1.68e?2），FOS无显著下调（log₂FC=?0.18，调整p=0.83）。

药物-靶点相互作用预测与分子对接验证

通过对LN相关枢纽基因（CCL2、JUN、FOS、JAK2）进行药物富集分析，沙利度胺被识别为关键调控候选药物。分子对接结果显示沙利度胺与CCL2、FOS、JAK2和JUN表现出显著结合亲和力。值得注意的是沙利度胺与CCL2的结合自由能（ΔG=?92.7?kcal/mol）是所有互作中最低的，形成三个稳定氢键，表明对CCL2最强的结合亲和力。这些发现 suggest 沙利度胺可能通过潜在相互作用CCL2调节炎症信号通路，在LN治疗中发挥潜在治疗效应。

讨论

本研究通过整合外周血转录组数据与系统生物学方法，系统阐明了LN中CS-DEGs的多维调控网络。生物信息学分析显示LN中60个CS-DEGs显著富集于功能类别包括病毒应答、髓系细胞分化、抗病毒防御和脂质代谢，以及与动脉粥样硬化、NOD样受体信号和流感A相关的通路。基于先前文献和机制研究见解，我们提出LN发病机制的"双击"模型：内源性核酸介导的病毒模拟和代谢紊乱-炎症轴失衡协同驱动免疫病理过程。具体而言，自身核酸（如核小体DNA和线粒体DNA）通过TLR7/9受体激活pDCs，诱导类似病毒感染的I型干扰素风暴（IFN signature）。通过STAT1/JAK2轴的异常信号维持干扰素刺激基因（ISGs）表达，从而促进Th1极化和抗dsDNA抗体产生。同时氧化低密度脂蛋白（oxLDL）通过CD36-NLRP3炎症小体通路触发IL-1β/IL-18异常释放，导致肾小球内皮损伤并与动脉粥样硬化显著相关。值得注意的是NLRP3激活进一步促进IRF5核转位，建立炎症-干扰素正反馈循环。这两种核心机制的相互作用为LN患者独特的肾脏-心血管共病提供了令人信服的解释。

基于PPI网络，本研究识别六个枢纽基因-STAT1、CCL2、MYD88、FOS、JAK2和JUN-并构建了LN免疫失调基础的核心调控模块。具体而言，MYD88-TLR7/9-IRAK4轴通过激活NF-κB和AP-1（即FOS/JUN异二聚体）显著上调趋化因子表达水平，如CCL2，从而介导单核细胞/巨噬细胞异常浸润肾脏。同时CCL2-MCP1/CCR2轴通过PI3K/AKT信号诱导足细胞细胞骨架重塑和肾小管上皮-间质转化，直接加剧蛋白尿和纤维化。新研究已在LN发病机制中识别 several 生物学上合理的ceRNA轴。值得注意的是Chen等证明lincRNA-p21通过调节凋亡和免疫激活在LN中起关键作用。LincRNA-p21作为ceRNA通过海绵吸附miR-181a，导致PUMA/Bax表达增加和肾细胞凋亡增强。我们的ceRNA网络分析显示CCL2和JUN通过竞争结合共享miRNAs（包括miR-338-3p）协同调节STAT1和CASP3表达。值得注意的是lncRNA LINC01165通过作为miR-338-3p的海绵解除对CCL2的抑制，这一机制与LN患者肾巨噬细胞浸润高度一致。此外转录因子网络分析表明由FOS/JUN和SP1形成的调控轴可能整合氧化应激信号，增强AP-1复合物活性，并放大JAK-STAT通路信号，从而驱动LN患者肾组织中T/B细胞的异常激活。总之，这些发现不仅突出非编码RNAs和转录因子网络在LN表观遗传调控中的关键作用，也为开发基于RNA干扰的治疗策略提供理论基础。

在治疗策略方面，分子对接结果表明沙利度胺对CCL2表现出高亲和力（ΔG=?92.7?kcal/mol），而其他候选药物（如suloctidil和N乙酰半胱氨酸（NAC））仍是值得未来研究的 compelling 候选药物。沙利度胺对CCL2的最高亲和力表明通过选择性抑制CCL2治疗难治性LN的潜在新方法。然而这一计算预测需要功能验证以评估治疗相关性。此外鉴于沙利度胺的致畸性和神经毒性，其安全性可通过结构修饰（如优化CRBN结合域）或靶向递送系统开发（如使用纳米载体局部给药）改善。基于本研究中识别的关键网络节点，未来研究可能优先考虑多靶点联合干预策略，如协同使用JAK2抑制剂（阻断STAT1磷酸化）、CCL2中和抗体（抑制单核细胞趋化）和NLRP3抑制剂（如MCC950）。此类方法可同时减轻肾脏炎症和心血管并发症。

尽管本研究阐明了LN的多维调控网络，几个技术考虑值得关注。验证队列中FOS缺乏统计显著性（调整p=0.83）可能反映有限统计效能检测中等效应大小，这尤其受样本量限制影响。然而通过以下方式 essential 进一步验证：利用单细胞测序技术系统评估肾组织中CS-DEGs的空间异质性；通过体外敲除和过表达实验确认关键lncRNAs（如LINC01043）在ceRNA网络中作为miRNA海绵的作用；使用体外细胞因子产生 assay 和体内LN模型评估沙利度胺对CCL2的体内抑制效应。未来研究将整合空间转录组学与类器官模型，全面研究免疫-代谢微环境与细胞衰老关联的时空动力学，并开发靶向JAK-STAT、NLRP3和CCL2通路的协同疗法以实现更有效的精准治疗。

结论

本研究通过整合外周血和肾组织转录组数据，系统识别了LN中60个CS-DEGs，阐明它们通过调节病毒应答、NOD样受体信号和氧化应激等关键机制在LN病理过程中的作用。进一步分析显示以枢纽基因（CCL2、JUN、FOS、JAK2）为核心的ceRNA网络和转录因子调控轴强调了免疫信号转导与环境应激之间的协同互作。此外沙利度胺与CCL2的高亲和力结合为靶向治疗提供有前景的新策略。未来研究应优先通过功能实验验证这些枢纽基因的具体调控机制，评估沙利度胺等候选药物在临床前模型中的疗效，并利用多组学数据全面分析LN中细胞衰老与免疫微环境互作的时空动力学。

数据可用性

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