空间蛋白质组学揭示原发性纤毛内在异质性及其细胞类型特异性信号枢纽功能

本研究通过抗体介导的空间蛋白质组学技术，首次在单纤毛分辨率水平绘制了人类三种细胞系中715种纤毛蛋白的空间分布图谱，发现69%的纤毛蛋白具有细胞类型特异性，78%存在单纤毛异质性，鉴定出91个新型纤毛蛋白（包括CFAP300作为新型纤毛标志物），并发现CREB3基因变异与纤毛病表型相关，为纤毛信号传导机制和纤毛病诊疗提供了突破性资源。

　　

纤毛是大多数真核细胞表面突出的微小毛发状结构，作为细胞的"天线"感知外界信号。尽管纤毛功能障碍会导致包括多指畸形、认知障碍、肥胖、肾脏缺陷、视网膜变性等多种临床表现的纤毛病（ciliopathies），但人们对不同细胞类型中纤毛的具体功能仍知之甚少。这主要是由于纤毛体积微小（约0.35飞升），且其膜结构与质膜相连，使得分离完整纤毛进行蛋白质组分析变得异常困难。

以往研究多采用邻近标记质谱法（proximity-labeling MS）来鉴定纤毛蛋白质组，但这些方法存在明显局限：缺乏单细胞分辨率、只能检测相对于细胞体富集的蛋白、需要将酶与纤毛蛋白融合可能干扰信号传导、在某些细胞类型中灵敏度有限，且无法应用于人体组织研究。

为了突破这些技术瓶颈，研究人员开发了基于抗体的空间蛋白质组学方法。他们利用人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）的抗体库，结合细胞核、纤毛和基体标记物，通过3D共聚焦显微镜成像技术，分析了三种不同类型人类细胞系（hTERT-RPE1、RPTEC/TERT1和ASC52telo）中1,992个候选蛋白在128,156个单个纤毛中的分布情况。

研究团队运用标准化免疫荧光染色流程，在96孔玻璃底板培养三种细胞系，通过血清饥饿诱导纤毛形成，使用4%多聚甲醛固定，Triton X-100透化，然后与一抗（HPA抗体及ARL13B、PCNT标志抗体）孵育过夜，再用荧光二抗（Alexa 488、555、647）标记，DAPI复染核。图像采集使用Leica SP8共聚焦显微镜，63倍水浸物镜，通过多通道顺序扫描避免串色。图像经专用FIJI插件处理并导入HPA实验室信息管理系统，由多名细胞生物学专家手动注释蛋白亚细胞定位，特别关注纤毛尖端、纤毛本体、过渡区和基体四个区域。

研究发现人类纤毛蛋白质组具有惊人异质性。研究人员鉴定出715个纤毛相关蛋白，其中91个是首次发现与任何类型纤毛相关，230个以前未在人类纤毛中通过MS或冷冻电镜技术发现。这些蛋白中69%表现出细胞类型特异性，78%在单个纤毛间存在异质性，表明纤毛能够调整其蛋白质组以适应环境感知和细胞反应计算的需求。

特别值得关注的是，研究发现纤毛是多种信号通路的枢纽。除了已知的Hedgehog信号通路，研究还揭示了纤毛中存在多种以前未确认的信号蛋白，包括激酶AKT1和AKT3、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶TAO1（TAOK1）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的催化亚基和调节亚基（PIK3CA、PIK3CD和PIK3R4）、黏着斑激酶PTK2、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶CAMK1G、蛋白磷酸酶2（PPP2R3C）、E3泛素蛋白连接酶MIB1、血管内皮生长因子受体3（FLT4）、GPCR OPRL1、src相关受体PDGFRA、TGF-β受体1（TGFBR1）和环核苷酸门控离子通道CNGA2等。

研究还发现纤毛蛋白具有多重定位特性。99%的纤毛蛋白同时定位在其他细胞区室，最常见的是基体、胞质溶胶、核质和微管。这种多重定位现象可能与纤毛向细胞体传递信息的功能相关。例如，转录因子GLI在纤毛中被翻译后修饰，然后被运输到胞质溶胶，最终进入细胞核调节Hedgehog基因转录。研究还发现其他转录因子存在于纤毛中，包括纤毛本体中的CRX和基体中的ATF3和CREB1，这些因子都同时定位于核质，支持了纤毛通过局部修饰转录因子来控制基因表达的假设。

不同细胞类型的纤毛蛋白质组显示出功能特化。RPTEC/TERT1细胞的纤毛似乎专门用于各种感觉信号通路，而hTERT-RPE1细胞的纤毛更专注于发育和形态发生，ASC52telo细胞的纤毛则显示与突触组织和谷胱甘肽代谢相关的蛋白。这种异质性在研究的三种细胞类型之外可能更加显著。

单纤毛异质性与细胞状态相关。研究发现389个纤毛蛋白（78%）在单个细胞间存在变异。与纤毛发生、微管和纤毛运输相关的蛋白在两个组中都有出现，而与信号传导、发育和形态发生相关的蛋白则显示出单细胞异质性。例如，RAB8A和RAB34表现出与纤毛发生相关的单细胞异质性，已知它们介导蛋白质运输以促进纤毛生长。一些GPCR（如LPAR3、SSTR3和HTR7）即使在血清饥饿、同步化的hTERT-RPE1细胞中也显示出跨纤毛的丰度变化。

研究发现CFAP300是一个稳定的纤毛标志物。除了ARL13B外，CFAP300是唯一在所有三种细胞系中稳定且独家鉴定于纤毛中的蛋白。研究人员证明CFAP300在不同人体组织中都是合适的纤毛标志物，例如在输卵管（动纤毛）、肾脏（原发性纤毛）、甲状腺（原发性纤毛）、肝脏（胆管细胞的原发性纤毛）和子宫颈（原发性纤毛）的免疫组化DAB染色中都能标记纤毛。

研究还探索了纤毛蛋白质组与疾病的关联。通过将715个产生纤毛蛋白的基因与在线孟德尔遗传在人（OMIM）数据库中的表型注释进行比较，发现324个基因在OMIM中有已知表型，338个基因在OMIM中无相关表型，53个基因未列入OMIM。在临床样本中，研究人员在一例具有纤毛病表型重叠特征的临床病例中发现了CREB3的遗传候选变异。

这项研究提供了对人类纤毛蛋白质组单细胞异质性的独特见解，为纤毛研究领域提供了宝贵资源。研究人员解析了细胞群体内和跨细胞类型的异质性域，观察到几乎所有研究的纤毛蛋白都存在多重定位，强调了纤毛信号通路的特异性，揭示了纤毛微域，识别了新的纤毛标志物，并利用他们的图谱搜索纤毛病候选基因。

研究结果表明，纤毛作为一个具有可变蛋白质组和功能的细胞区室，细胞可能利用纤毛来定制感觉和信号转导能力以适应个体细胞角色。纤毛异质性可能调节细胞状态，如细胞周期、纤毛发生、信号传导和代谢活性。所有这些数据都可以在https://www.proteinatlas.org上公开探索，以加速关于纤毛和纤毛病的基础和临床研究。

研究的局限性在于基于三种永生化细胞系的高通量免疫染色得出结论，技术上的注意事项包括对这些细胞类型之外的蛋白质组异质性的推断。抗体特异性是应用依赖性的，需要实验验证，研究人员使用了经过严格标准化质量控制流程生成的HPA抗体，但仍建议研究人员对特定蛋白质感兴趣时检查可用的验证数据。关于纤毛蛋白质组列表，重要的是要考虑他们采用了靶向筛查，仅限于1,992个候选蛋白，未在此研究中报告或鉴定的蛋白质可能仍然存在于纤毛中。