抑制肥胖状态下内脏脂肪组织脂解可防止内皮Kir2.1通道功能损伤并改善血管功能障碍

本刊推荐：本研究深入探讨了肥胖状态下内脏脂肪组织（VAT）通过脂解作用释放脂肪酸（FAs），经CD36介导的内皮细胞摄取，导致内向整流钾通道（Kir2.1）功能损伤的分子机制。通过使用特异性ATGL抑制剂（Atglistatin/NG-497）抑制脂解，可显著改善VAT诱导的内皮Kir2.1功能障碍和脂肪酸摄取异常，为肥胖相关心血管疾病的治疗提供了新的靶点（Kir2.1/CD36/ATGL）和干预策略。

　　

引言

腹部内脏脂肪组织（VAT）的积累是胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病风险的主要因素。与皮下脂肪组织（SAT）相比，VAT表现出增加的炎症特征和改变的代谢效率。VAT是肥胖条件下循环游离脂肪酸（FAs）升高和胰岛素抵抗的主要贡献者。此外，位于VAT中的动脉表现出显著的内皮功能障碍，这是心血管疾病的一个明确前兆，也可能由FAs增加引起。

最近的研究表明，肥胖小鼠的VAT在体外损害内皮内向整流K⁺ 2.1通道（Kir2.1）功能，而瘦小鼠的VAT以及瘦或肥胖小鼠的SAT没有影响。Kir2.1通道是内皮功能的关键调节因子，已被证明有助于一氧化氮生产、平滑肌的内皮依赖性超极化和血管生成。在饮食诱导的肥胖小鼠模型和肥胖人类中，VAT与SAT动脉内皮中Kir2.1功能存在 dichotomy（二分性）。具体来说，Kir2.1在VAT动脉内皮中严重功能障碍，但在SAT动脉内皮中保持功能。进一步的研究表明，在CD36表达降低的内皮细胞和肥胖CD36敲除小鼠的VAT动脉内皮中，Kir2.1功能得到恢复，表明VAT通过CD36抑制Kir2.1。这些发现支持VAT通过损害Kir2.1在介导内皮功能障碍中发挥潜在的旁分泌作用；然而，VAT与内皮CD36在Kir2.1损伤上游之间的联系尚未建立。

材料与方法

动物研究经特拉华大学机构动物护理和使用委员会批准。9周大的C57BL/6J WT小鼠购买自杰克逊实验室，在12小时光暗循环下饲养。10周大的小鼠随机分为饮食组：瘦对照组维持正常实验室饮食，肥胖组喂食高脂肪西方饮食（42% kcal来自脂肪）。饮食自由提供，维持8-10周，此时观察到明显的体重增加和稳健的内皮功能障碍。小鼠通过颈椎脱位处死，随后开胸。分离腹部和后肢区域的SAT以及肠系膜VAT用于体外研究。VAT和SAT在HEPES缓冲液中处理，并在解剖当天用于处理细胞。

人类研究经基督教健康系统机构审查委员会批准，与减肥手术计划的外科医生合作进行。研究涉及的人类参与者按照赫尔辛基宣言的指南进行。研究招募的参与者在计划的减肥手术日期之前提供书面知情同意。受试者（n = 4）的体重指数范围从44.9到50.3，年龄在29至47岁之间。排除标准包括癌症、心脏病、吸烟史、肾脏或肝脏疾病、胆囊疾病或自身免疫/炎症性疾病。参与者还被排除如果他们的高血压或高胆固醇血症未被药物控制，因为这些风险因素已被证明会损害内皮Kir通道。患者药物列在补充表S2中。所有受试者信息被去标识化并存储在密码保护的现场硬盘驱动器中。在手术期间由减肥外科医生根据IRB协议收集大约1克腹部SAT和VAT（网膜）脂肪活检。特拉华大学实验室的一名成员在手术当天检索活检，并将组织以约50毫克等分试样存储在液氮中直至使用。

人脂肪微血管内皮细胞（HAMECs）在标准培养条件下使用内皮细胞培养基和补充剂维持。使用低传代细胞（P2-P4）进行所有实验。细胞接种至约80%汇合度，并允许形成单层，然后与来自瘦或肥胖小鼠或肥胖人类的脂肪组织（5 mg/ml）进行整块处理，如先前所述。细胞与脂肪组织在标准培养条件下孵育48小时，然后进行下游分析。未处理的细胞用作对照。为了抑制来自小鼠的VAT或SAT中的脂肪组织脂解，脂肪组织在处理前在37°C的培养基中与20 μM Atglistatin或0.002% DMSO（载体对照）孵育2小时。为了抑制来自人类受试者的VAT或SAT中的脂肪组织脂解，脂肪组织在处理前在37°C的培养基中与500 nM NG-497或0.0005% DMSO（载体对照）孵育2小时。为了确定CD36下调在体外的效果，在50%汇合度的HAMECs中使用针对CD36的siRNA或乱序siRNA对照使用Lipofectamine（RNAiMax）进行转染，按照制造商的说明，然后在用PA处理细胞之前进行。

使用全细胞电压钳记录HAMECs中的内向整流K⁺电流。使用厚壁硼硅玻璃移液管， fire polishing后电阻为3-5 MΩ。电流在高60 mM K⁺浴中记录，以检测内向整流K⁺电流，使用EPC10放大器和随附的采集与分析软件。HAMECs保持在-30 mV，应用从-140到+40 mV的电压斜坡，持续400 ms。电流低通滤波在2 kHz，记录数字化在10 kHz。在收集数据进行分析之前，内向整流K⁺电流稳定。对于被接受进行离线分析的记录，需要在电压斜坡协议期间保持稳定的膜电阻和串联电阻≤10 MΩ，该协议包括在静态浴中至少20个稳定记录。电流归一化到细胞电容以获得电流密度（pA/pF）进行分析。必要时，进行离线漏减以在-100 mV处收集最准确的数据点进行组分析。

免疫细胞化学（ICC）用于评估Kir2.1和CD36的表达。脂肪组织处理后，细胞用RT PBS洗涤2次，然后在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定15分钟，不进行透化。固定后，在95°C下在抗原修复缓冲液（Tris-EDTA, pH 9.0）中进行热介导的表位修复5分钟。将样品从热源中取出5分钟，该过程重复两次。吸弃抗原修复缓冲液，细胞在室温下用5% BSA在PBS中封闭一小时，缓慢摇动。封闭后，细胞用PBS洗涤两次，每次10分钟。针对CD36（R&D Systems，多克隆山羊抗小鼠CD36）或Kir2.1（Abcam，兔单克隆）细胞外表位的初级抗体在含有1% BSA的PBS中稀释1:100。细胞在4°C黑暗中与初级抗体孵育过夜，轻轻摇动。细胞用RT PBS在室温下轻轻摇动洗涤两次，每次5分钟。然后细胞与相应的二级抗体（驴抗山羊Alexa Fluor 488用于检测CD36，山羊抗兔Alexa Fluor 647用于检测Kir2.1）在含有1% BSA的PBS中稀释1:100，在室温黑暗中孵育1小时。细胞再次用RT PBS洗涤两次，每次10分钟。细胞用DAPI染色并浸泡在PBS中。使用EVOS荧光显微镜在10倍放大下捕获免疫荧光图像，每个样品至少拍摄三个不同的视野进行分析。背景扣除后，由盲法研究者使用ImageJ测量每个图像的平均荧光强度（MFI），然后归一化到视野中通过计数DAPI染色的细胞核确定的细胞数。计算每个视野的平均MFI/样品，然后归一化到每个独立实验中类似处理的对照未处理细胞。每个实验还包含抗体对照样品，这些样品孵育时不加初级抗体，只加1% BSA在PBS中。为了进一步确认ICC中初级抗体的特异性，使用了针对每个靶基因的siRNA。

使用QBT脂肪酸摄取试剂盒测定体外脂肪酸摄取。该试剂盒使用BODIPY荧光十二烷酸类似物，先前已验证作为脂肪酸转运蛋白的合适底物，类似于天然存在的脂肪酸，以及一种专用的淬灭剂。脂肪组织处理后，丢弃组织，HAMECs用RT PBS洗涤2次。细胞在37°C下与荧光脂肪酸孵育90分钟之前血清饥饿一小时。然后洗涤细胞并浸泡在新鲜PBS中进行成像，使用EVOS荧光显微镜。活细胞在10倍放大下成像，每个样品收集三到六个视野进行分析。背景扣除后，由盲法研究者在Image J中测量整个视野的MFI，归一化到明场确定的细胞数，每个视野/样品的平均值用于获得每个样品的最终MFI值。实验值归一化到对照的MFI，未处理细胞在每个独立实验中进行类似处理。

结果

抑制肥胖小鼠和人类VAT中的脂解可防止VAT介导的内皮Kir2.1功能损伤

最近的研究揭示了肥胖小鼠的VAT以CD36依赖性方式抑制内皮Kir2.1功能，表明VAT/CD36/Kir2.1轴是肥胖诱导的内皮功能障碍的潜在贡献者。本研究假设VAT衍生的FAs是Kir2.1功能障碍的原因，基于以下证据：i) VAT脂解是肥胖条件下循环FAs水平的主要贡献者；ii) CD36是一种已确立的FA转位酶，似乎在肥胖条件下是Kir2.1损伤所必需的；iii) Kir2.1已被证明被内部FA衍生物抑制。确实，Kir2.1损伤和过量FAs都与肥胖诱导的内皮功能障碍有关；然而，迄今为止尚无研究确定FA介导的Kir2.1损伤是否作为一种潜在机制。

因此，我们的第一个目标是确定外源性FAs是否以CD36依赖性方式抑制Kir2.1，类似于我们观察到的内皮细胞受到肥胖小鼠VAT挑战的情况。确实，PA削弱了Kir2.1功能，这种效应通过下调内皮CD36得以预防，从而首次表明VAT衍生的FAs可能起作用。为了确定VAT衍生的FAs是否是内皮Kir2.1损伤的潜在介质，我们通过抑制肥胖小鼠和人类VAT中的ATGL来防止脂解中的限速步骤，然后在体外将内皮细胞暴露于VAT。这种方法防止了VAT诱导的内皮Kir2.1功能损伤，并支持VAT衍生的FAs作为Kir2.1功能的旁分泌介质的作用。

肥胖小鼠和人类的VAT不会显著影响Kir2.1或CD36的表达

先前的研究表明，肥胖不影响VAT动脉内皮中Kir2.1的表达。我们进一步表明，脂肪组织对内皮Kir2.1或CD36的表达没有影响，无论储存类型（SAT与VAT）或来源（瘦与肥胖小鼠）。为了更好地评估VAT是否影响靶蛋白的膜表达，我们使用针对Kir2.1和CD36细胞外表位的抗体在未透化的内皮细胞上进行了免疫细胞化学（ICC），然后进行免疫荧光成像。通过评估二级抗体的特异性（在没有初级抗体的情况下存在蛋白质靶标）和使用siRNA敲低来评估在没有蛋白质靶标的情况下初级抗体的特异性，首先确认了该方法的抗体验证。与对照和未处理细胞相比，处理来自瘦或肥胖小鼠的VAT或SAT时，未检测到内皮Kir2.1或CD36的显著差异，从而支持我们最初的发现。为了确定这些发现是否适用于人类肥胖，我们将内皮细胞与来自图2和图3中相同人类受试者的VAT或SAT一起孵育。虽然来自四名肥胖受试者的SAT和VAT与未处理的对照细胞相比都没有显著改变Kir2.1或CD36的表达，但数据中的巨大差异和趋势表明，在更大的样本量中可能存在差异。对于内皮CD36来说尤其如此，去除一个异常值受试者后，暴露于SAT或VAT的细胞中CD36表达显著降低（Kruskal Wallis检验，p = 0.0464）。然而，当比较Kir2.1的归一化SAT和VAT平均FI值时，没有观察到明显差异（使用Mann Whitney检验，p = 0.8857），CD36也没有（使用Mann Whitney检验，p > 0.9999），这进一步支持VAT不会特异性诱导肥胖中Kir2.1或CD36表达的差异。考虑到VAT对Kir2.1的功能影响和CD36的关键作用，这些发现表明VAT诱导了使Kir2.1功能失调的事件，而没有差异性地影响这些蛋白质的表达。

抑制肥胖小鼠和人类VAT中的脂解显著减弱内皮细胞中的脂肪酸摄取

基于我们最近的发现，显示肥胖小鼠的VAT诱导FA摄取增加，以及我们目前的发现，揭示抑制肥胖小鼠和人类VAT中的脂解可恢复Kir2.1功能，我们接下来旨在确定i) 外源性FA是否类似地诱导FA摄取增加，揭示一种可能的FA诱导的FA摄取机制，以及ii) 抑制VAT脂解是否类似地预防内皮FA摄取，正如我们最近在缺乏CD36的内皮细胞中观察到的那样。这是通过在对内皮细胞进行PA或脂肪组织暴露后对内在化荧光FA类似物进行成像来实现的，如先前所述。

正如我们先前使用肥胖小鼠VAT的研究中所观察到的，PA诱导了与对照条件相比FA摄取的显著增加。为了进一步评估VAT衍生的FAs在介导内皮FA摄取增加中的作用，我们在将内皮细胞与脂肪组织进行整块暴露之前，用Atglistatin处理来自瘦或肥胖小鼠的SAT和VAT。如图所示，未接受脂肪处理的对照细胞表现出基础水平的FA摄取，瘦小鼠的SAT、肥胖小鼠的SAT或瘦小鼠的VAT均未显著改变（与对照细胞相比，这些组的平均荧光增加约15-20%）。相反，与我们之前的发现一致，肥胖小鼠的VAT诱导的平均荧光增加超过53%，与对照细胞相比。暴露于用Atglistatin处理的脂肪组织的内皮细胞显示，与用载体对照处理的来自相同小鼠的脂肪组织相比，FA摄取显著减少，与脂肪储存库（即SAT与VAT）或来源（即瘦与肥胖）无关，表明抑制任何这些脂肪储存库中的脂解都可以有效减弱内皮FA摄取。然而，与匹配的载体处理的脂肪组相比，在Atglistatin处理的组中观察到的荧光减少程度存在显著差异。具体来说，暴露于Atglistatin处理的瘦小鼠VAT或瘦或肥胖小鼠SAT的内皮细胞表现出类似的平均荧光减少约40%，而暴露于Atglistatin处理的肥胖小鼠VAT的细胞表现出更显著的平均荧光减少约65%。当比较瘦和肥胖小鼠的SAT和VAT中载体减去Atglistatin的差值时，Atglistatin对VAT介导的FA摄取增加的影响得到进一步强调。为每个处理组（即载体与Atglistatin）生成的归一化值用于生成代表Atglistatin诱导的抑制对每个单独小鼠脂肪组织样品中内皮FA摄取影响的荧光强度值。该分析显示，内皮FA摄取受到Atglistatin处理的SAT的类似影响，无论是在瘦小鼠还是肥胖小鼠中。相反，与暴露于瘦对照VAT的细胞相比，暴露于肥胖小鼠VAT的细胞中存在显著的Atglistatin介导的对内皮FA摄取的影响，从而支持在肥胖小鼠中VAT诱导的内皮FA摄取增加通过抑制脂解得以显著减少。

为了确定这些发现是否适用于人类肥胖，我们将内皮细胞与来自图2和图3中相同人类受试者的VAT或SAT一起孵育。与我们最近比较肥胖小鼠VAT和SAT的发现类似，VAT诱导了内皮细胞中FAs的显著摄取，而与相同受试者的SAT相比，暴露于SAT的细胞显示无显著差异。用NG-497抑制SAT ATGL与暴露于载体处理的SAT的细胞相比，对内皮细胞FA摄取没有影响。相反，抑制VAT ATGL导致与 respective 载体处理的对照VAT相比，内皮细胞FA摄取急剧下降，这一发现与我们在本研究中使用饮食诱导的肥胖小鼠模型的观察结果一致。

讨论

内脏肥胖现在被认为是心血管疾病的重要风险因素，腹部VAT的积累与疾病进展密切相关。鉴于脂肪组织现在被认为是一种重要的内分泌和旁分泌组织，具有调节血管功能的能力，了解VAT在介导肥胖诱导的内皮功能障碍中的作用可能会揭示对抗疾病进展的新靶点。在这里，我们扩展了我们最近的发现，揭示了一个推定的VAT/CD36/Kir2.1轴，其中我们显示VAT以CD36依赖性方式诱导内皮Kir2.1损伤。具体来说，这些发现将VAT与CD36的上调联系起来，CD36是一种清道夫受体和FA转位酶，在心血管疾病进展中已得到充分证实，是驱动肥胖中Kir2.1功能障碍的上游事件。然而，VAT如何调控这一轴仍未解决。

在本研究中，我们通过评估VAT作为潜在旁分泌组织的作用，重点关注VAT衍生的FAs，进一步探讨了VAT在介导内皮Kir2.1损伤中的作用。我们关于抑制肥胖小鼠和人类受试者VAT中脂解可预防Kir2.1损伤的假设基于以下证据：首先，FAs从VAT中释放是胰岛素抵抗和心血管疾病的主要贡献者。因此，过量的FAs已被充分证明会诱导内皮功能障碍。此外，我们最初的发现将CD36（一种主要的内皮FA转位酶）与Kir2.1通道的损伤以及VAT暴露后增强的内皮FA摄取联系起来。最后，Kir通道先前已被证明被几类FA衍生物抑制。因此，我们首先旨在确定外源性添加生理上丰富的FA——棕榈酸（PA），是否重现了我们最初的发现，即VAT通过CD36损害内皮Kir2.1。确实，PA削弱了Kir2.1功能，这种效应通过下调内皮CD36得以预防，从而首次表明VAT衍生的FAs可能起作用。为了确定VAT衍生的FAs是否是内皮Kir2.1损伤的潜在介质，我们通过抑制肥胖小鼠和人类VAT中的ATGL来防止脂解中的限速步骤，然后在体外将内皮细胞暴露于VAT。这种方法防止了VAT诱导的内皮Kir2.1功能损伤，并支持VAT衍生的FAs作为Kir2.1功能的旁分泌介质的作用。

VAT衍生的FAs在损害Kir2.1功能中的潜在作用

我们最近表明，肥胖小鼠的VAT不影响内皮细胞中总的Kir2.1或CD36表达，通过蛋白质印迹评估。然而，这种方法不能揭示膜表达，膜表达可能独立于总蛋白受到差异调节。因此，我们在未透化的细胞上使用针对Kir2.1和CD36细胞外表位的抗体进行了ICC，以更好地观察暴露于脂肪组织后膜表达的潜在改变。我们以这种方式评估表达的发现进一步支持VAT不会诱导Kir2.1或CD36表达的变化，并且当与观察到的响应肥胖小鼠和人类VAT的Kir2.1功能损伤和增强的脂肪酸摄取相结合时，提示每种蛋白质的功能发生了改变。

FAs在调控内皮功能障碍中的作用已在先前的研究中得到充分调查，指出诱导氧化应激是一个主要机制。FAs已被证明在许多细胞类型中促进活性氧（ROS）的形成，包括内皮细胞。ROS产生升高会损害无数的细胞成分，可能包括Kir2.1和/或通道的基本调节因子。我们和其他人已经表明，内皮糖萼——一种富含糖的细胞外延伸进入血管腔的结构——在肥胖条件下被降解。这一点值得注意，因为i) 糖萼对ROS介导的破坏已确立的敏感性，以及ii) 我们之前的发现，即内皮糖萼正向调节Kir2.1活性。因此，FA依赖性的ROS增加随后破坏糖萼可能间接导致Kir2.1通道在肥胖中功能失调；然而，VAT是否明确破坏肥胖中的内皮糖萼仍有待确定。此外，ROS可能具有直接抑制Kir2.1的能力，虽然这尚未 specifically 针对Kir2.1显示，但它包含相关残基，因为其他Kir通道已被证明在氧化条件下受到抑制。

虽然FAs和ROS与内皮功能障碍有明确的联系，但Kir2.1通道也众所周知对脂质环境敏感，具有 distinct 脂质正向调节通道功能（例如PIP2）和其他抑制通道的脂质（例如胆固醇）。不同类别的FA衍生物也已被证明抑制Kir2.1通道，包括长链脂肪酰基CoA酯和神经酰胺，并且已经为这些代谢物提出了直接和间接的抑制机制。基于在外源性PA和肥胖小鼠VAT存在下Kir2.1抑制的CD36依赖性，内部化和随后FAs转化为这些脂质代谢物之一（即神经酰胺、长链酯）可能驱动内皮Kir2.1功能障碍。未来的研究应阻止FA衍生物的形成，例如抑制将FAs转化为神经酰胺的酶，以确定这是否在VAT和FAs存在下恢复Kir2.1功能。此外，脂质膜的重排和/或PIP2的置换，这些事件也可能影响Kir通道，是CD36介导的FAs摄取后可能发生的事件。

确定这些机制中一种或多种是VAT和FA诱导的Kir2.1损伤的基础，代表了在揭示预防Kir2.1损伤以及因此肥胖中内皮功能障碍的合适靶点方面向前迈出的重要一步。此外，最近的发现表明，Kir2.1受脂质调控可能在血管系统中具有细胞类型依赖性。这一证据强调了 distinct 脂肪组织储存库在生理和疾病条件下对Kir2.1和其他血管离子通道的差异调控中的作用，可能是由旁分泌FAs介导的。

解读肥胖中推定的VAT/FA/CD36/Kir2.1轴的治疗意义

甘油三酯分解最终产生游离FAs是一个多酶过程，其限速步骤是ATGL介导的初始FA从甘油上分离。先前Mayer等人（2013）和Grabner等人（2022）的努力旨在识别合适的脂解抑制剂，产生了两种 distinct 小分子抑制剂，分别针对小鼠（即Atglistatin）和人类（即NG-497）ATGL。这些研究表明，每种抑制剂在体外 drastically 减弱脂解，并且Atglistatin在体内显著降低小鼠循环游离FAs。在本研究中，我们揭示通过分别使用抑制剂靶向ATGL抑制肥胖小鼠和人类VAT中的脂解， ex vivo 防止了VAT诱导的Kir2.1损伤。此外，在小鼠和人类VAT中Atglistatin或NG-497处理与仅用载体处理的相同小鼠和人类的对照VAT相比，显著降低了内皮FA摄取。本研究中后一发现，加上PA诱导的内皮FA摄取增加的观察，重现了我们最初的内皮CD36下调观察结果。总之，这些发现指出了一种由VAT启动的CD36介导的FA摄取机制的作用，该机制导致Kir2.1损伤，促使进一步研究VAT/FA/CD36/Kir2.1轴作为肥胖内皮功能障碍的贡献者。

肥胖中脂肪甘油三酯储存中FA动员升高是胰岛素抵抗的一个已确立的贡献者，与脂肪组织炎症作为驱动因素有关。先前的研究表明，在体内抑制脂肪组织脂解，包括用Atglistatin靶向ATGL，在肥胖和糖尿病 rodent 模型中恢复全身胰岛素敏感性。重要的是，我们的发现也暗示了抑制VAT脂解作为对抗心血管疾病进展手段的潜在治疗益处，可能通过恢复内皮功能。内皮Kir2.1通道是血管运动张力的关键调节因子，在响应机械和受体介导的线索中发挥促进血管舒张的重要作用。因此，内皮Kir2.1功能丧失导致减弱的内皮依赖性舒张反应，这是内皮功能障碍的一个标志，从而作为晚期疾病的潜在前兆。确实，我们最近表明，Kir2.1表达减弱在血脂异常小鼠模型中导致加剧的动脉粥样硬化病变形成，进一步支持该通道在维持血管稳态中的重要作用。虽然本研究未直接评估内皮功能，但我们的发现表明，药理学靶向脂肪脂解，特别是通过抑制ATGL，可能是一个有前途的途径，通过预防VAT诱导的内皮Kir2.1损伤来恢复肥胖中的内皮功能。

局限性与其他考虑

目前的体外研究揭示了肥胖诱导的内皮功能障碍中一种新颖的VAT/FA/CD36/Kir2.1轴，尽管我们尚未在体内确立该轴的具体作用。肥胖是一种复杂的、多因素的代谢状况，许多变量可能起作用。本研究需要注意的一个重要点是，尽管抑制了ATGL并 presumably 减弱了VAT中的FA释放，如先前所示，但这在我们的研究中未直接测试。因此，抑制ATGL可能影响与脂肪衍生的ROS生产和/或脂肪因子分泌相关的无数信号过程，尽管这些因素是否损害内皮Kir2.1仍有待确定。此外，ATGL在驻留巨噬细胞中表达，这些细胞存在于我们的整块培养方法中，可能代表导致Kir2.1损伤的有效细胞类型，可能是通过炎症信号。在解析驱动内皮Kir2.1功能障碍的脂肪细胞、驻留巨噬细胞和 distinct 脂肪衍生介质的作用时，应考虑细胞类型特异性消融ATGL和免疫细胞耗竭研究。

我们的发现还表明，Kir2.1功能减少，而不是通道表达减少，是VAT诱导的Kir2.1损伤的基础。然而，虽然全细胞膜片钳技术是评估细胞中Kir通道功能的标准方法，因为它允许容易比较大的内向整流电流，但它不直接告知通道开放概率。在内皮细胞和相关表达系统中评估相关单通道配置（例如 inside-out, outside-out patches）中的Kir2.1功能将直接解决VAT和FAs是否降低通道的开放概率。此类研究，特别是在 inside-out 配置中，还将确定VAT衍生的FAs是否具有通过结合细胞内残基直接和急性抑制Kir2.1的能力，这种效应将支持在完整细胞中对CD36介导的FA内在化的依赖性。然而，还应注意的是，VAT衍生的FAs对其他离子通道和信号介质的影响可能作为内皮功能障碍的补充甚至平行路径。其他主要内皮离子通道，包括Piezo1和 transient receptor potential (TRP) 通道家族的 select 成员（例如 TRPM2/4）， each 已被证明被饱和FAs以可能促进内皮功能障碍的方式调制。与内皮Kir2.1通道类似，Piezo1通道的激活（已被证明被FAs抑制）也与一氧化氮生产和内皮依赖性血管舒张有关。相反，FA诱导的TRPM4表达增加和TRPM2通道的激活，可能响应FA诱导的氧化应激， each 被证明导致Ca²⁺超载，这是一个促进细胞死亡和内皮功能障碍的事件。由于我们尚未确定 specifically 预防VAT诱导的内皮Kir2.1损伤是否恢复完整动脉中的内皮功能，这些离子通道很可能属于收敛过程，共同削弱关键血管舒张介质的产生，最终导致内皮功能障碍。

虽然人类数据揭示了对内皮Kir2.1功能和FA摄取的强大影响，但仅呈现了四名肥胖受试者的数据。这个小样本量尚不允许根据人口统计学/临床值或药物差异对数据进行分层，这些分析无疑将扩展我们对这一人群中肥胖诱导的内皮功能障碍的理解。最后，虽然SAT作为VAT对内皮细胞功能影响的 within-subject 对照是合适的，但由于活检收集的来源（即减肥手术），瘦“健康”对照在人类研究中不可用。因此，在缺乏非肥胖个体脂肪的情况下，仅使用此人类脂肪组织来源解释我们的发现具有有限的普遍性，因为我们尚不能确认瘦个体的VAT对内皮Kir2.1和内皮FA摄取没有影响。未来的转化研究包括接受允许获取相关脂肪组织（例如疝气修复）手术的非肥胖个体，可能在评估VAT在肥胖诱导的内皮功能障碍中的作用时提供增加的严谨性。然而，在考虑这一人群作为瘦和/或“健康”对照时应谨慎行事。

结论

我们的发现增进了我们对VAT在介导内皮细胞功能障碍中作用的理解，并突出了脂解和FAs对肥胖中Kir2.1通道的影响。目前的发现，产生自饮食诱导的肥胖小鼠模型和肥胖人类的脂肪组织，表明VAT衍生的FAs促进内皮Kir2.1功能障碍，可能继发于FA摄取升高，作为调控肥胖诱导的内皮功能障碍的潜在机制。未来的研究应进一步调查VAT/FA/CD36/Kir2.1轴在肥胖诱导的内皮功能障碍背景下的作用。