SPCA2介导的STIM1-ORAI1非钙库依赖性激活调控分泌上皮细胞基底CFTR活性的新机制

本研究针对分泌上皮细胞中基底离子分泌的调控机制展开深入探索，揭示了顶端膜纳米结构域内SPCA2、STIM1/ORAI1、腺苷酸环化酶(ACs)与CFTR形成的信号复合物。研究人员发现SPCA2驱动构成性、钙库非依赖性但STIM1依赖的ORAI1钙内流，通过局部钙信号转化为cAMP以维持未刺激细胞中CFTR的基础活性及离子分泌。该发现阐明了胰腺、气道和肝脏上皮细胞分泌自我调节的重要机制，为相关分泌疾病的治疗提供新靶点。

　　

在分泌上皮细胞中，离子和液体的定向转运对维持器官生理功能至关重要，而囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)的活性是决定上皮离子分泌的关键限速步骤。CFTR的功能受到环磷酸腺苷(cAMP)和钙离子(Ca²⁺)信号的精细调控，这两种信号系统的协同作用如何实现时空特异性调控，尤其是在未受刺激的细胞中如何维持基础分泌活性，长期以来是领域内的重要科学问题。

以往研究主要集中在细胞在激素或神经刺激下的激活机制，而对基底状态下CFTR的活性调控了解甚少。尤其令人困惑的是，在未受刺激的分泌上皮细胞中，CFTR仍保持一定的基础活性，这对于维持管腔表面的液体平衡和保护功能至关重要。这种基础活性的分子机制及其组织特异性一直是不清楚的。

为了解决这一问题，Kiss、Varga等研究人员在《Current Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们发现了一种顶端膜纳米结构域，其中包含分泌途径Ca²⁺-ATP酶2(SPCA2)、基质相互作用分子1(STIM1)/钙释放激活钙通道蛋白1(ORAI1)、腺苷酸环化酶(ACs)和CFTR。在这个复合物中，SPCA2通过激活ORAI1并促进STIM1/ORAI1相互作用，促进构成性的、钙库非依赖性但STIM1依赖的ORAI1介导的Ca²⁺内流，这对基础CFTR功能至关重要。

研究团队运用了多种关键技术方法：使用小鼠和人类胰腺、肝脏和气道类器官模型作为研究系统；通过超分辨率直接随机光学重建显微镜(dSTORM)技术揭示蛋白在顶端膜的纳米级分布；采用荧光寿命成像(FLIM)-荧光共振能量转移(FRET)技术分析蛋白质间相互作用；通过膜片钳技术记录ORAI1电流特性；利用钙成像和氯离子敏感染料(MQAE)评估离子通道活性；并通过体内外液体分泌实验验证生理功能。

ORAI1介导的细胞外Ca²⁺内流在原代极化上皮细胞中构成性活跃

研究人员首先通过RNA测序发现小鼠和人类胰腺导管类器官中表达了所有3个Orai家族成员(Orai1/2/3)、内质网钙传感器Stim1和Stim2以及调节蛋白Saraf。ORAI1主要定位在胰腺导管细胞的顶端质膜上。令人惊讶的是，在未刺激的小鼠导管片段中，使用选择性ORAI1抑制剂CM5480显著降低了基础钙水平，而移除细胞外Ca²⁺也触发了细胞内Ca²⁺浓度的显著下降。这种构成性活性在胰腺腺泡细胞中不存在，表明其具有细胞类型特异性。通过使用基因编码的钙传感器pcDNA3-D1ER直接测量ER钙库含量，证实ER钙库并未耗尽。基因敲低实验表明，siOrai1和siStim1处理均能消除对CM5480的反应，并降低基础钙水平。

SPCA2维持原代上皮细胞中的构成性ORAI1活性

通过全转录组分析，研究人员发现胰腺类器官中表达了多种STIM1/ORAI1相互作用蛋白，其中三种不同的钙库非依赖性调节因子——Spca1-2和Septin7——被确定。功能实验显示，siSPCA2处理降低了基础钙水平，并显著降低了未刺激小鼠原代导管上皮细胞中的构成性ORAI1介导的细胞外钙内流，而siSPCA1或siSEPT7没有效果。SPCA2显示与ORAI1和SERCA2以及内质网标记物calnexin显著共定位，而与高尔基体和囊泡标记物的共定位明显较低。在人类胰腺类器官中，SPCA2显示 both 细胞内表达模式和显著的顶端存在。

SPCA2在STIM1存在和不存在情况下增加ORAI1电流

电生理记录显示，SPCA2可以在不依赖STIM1的情况下激活ORAI1电流，也可以在STIM1存在的情况下影响ORAI1活性。SPCA2增加了STIM1-ORAI1电流密度并导致电流失活的延迟增加。值得注意的是，增加的慢电流失活在含有10 mM BAPTA的移液管溶液中被观察到，此时失活最小或不发生。这种形式的慢ORAI1电流失活是由SERCA泵介导的，是由于ORAI1、STIM1和SERCA复合物的组装。

SPCA2增加STIM1和ORAI1之间的相互作用

研究人员发现，在未刺激的HeLa细胞中，过表达的SPCA2和STIM1显示网状内质网表达模式，STIM1没有明显的点状形成。dSTORM显示，STIM1和SPCA2在内质网的焦平面中重叠。在未刺激情况下，SPCA2显著增加了STIM1-ORAI1共簇的数量。FLIM-FRET测量显示，SPCA2显著增加了FRET效率，而CPA处理进一步增加了FRET效率。这些发现表明，SPCA2增强了未刺激细胞中STIM1-ORAI1的聚类。

ORAI1介导的SICE调节胰腺导管上皮细胞中的CFTR活性和液体分泌

免疫荧光和dSTORM分析证实了CFTR和ORAI1在胰腺导管类器官顶端膜上的共定位。功能实验表明，抑制ORAI1或通过BAPTA-AM螯合细胞内Ca²⁺显著抑制了CFTR介导的氯离子外流。基因敲低ORAI1或STIM1也显著降低了氯离子外流。值得注意的是，较高的forskolin刺激的最大CFTR氯离子外流不受ORAI1抑制的影响，表明刺激的分泌不依赖于SICE。这些发现表明，自发的ORAI1介导的SICE对导管上皮细胞中的基础CFTR活性具有特定和主要影响。

ORAI1介导的SICE通过Ca²⁺依赖性ACs调节CFTR活性

转录组分析显示，小鼠和人类胰腺导管类器官中表达了多种腺苷酸环化酶基因(Adcy)。dSTORM和聚类分析显示，CFTR与AC1、AC3和AC8紧密接近，与AC6的共定位有限。这些ACs也与ORAI1在共转染的HeLa细胞中共定位。三色dSTORM证实了CFTR、ORAI1和AC1、3或8在相同的PM纳米结构域中。基因敲低实验表明，沉默AC1/3/8的表达显著损害了未刺激小鼠胰腺导管片段中的氯离子外流。在siAC1/3/8处理的导管片段中，应用CM5480不会进一步损害CFTR介导的氯离子外流，表明作用于同一通路。

研究结论表明，SPCA2通过STIM1/ORAI1介导的构成性钙内流调节上皮离子分泌，这对极化分泌上皮细胞中的基础CFTR活性至关重要。此外，研究人员发现了一个由SPCA2/STIM1/ORAI1、CFTR和Ca²⁺激活的AC1、3和8组成的顶端膜蛋白纳米结构域，突出了基础和刺激分泌的不同调控机制。

该研究的重要意义在于揭示了分泌上皮细胞中自我导向的调控机制，这种机制独立于神经激素刺激，能够根据各种刺激调整离子和液体分泌。这一发现不仅深化了对上皮生理学的理解，而且为治疗囊性纤维化、胰腺炎和其他分泌相关疾病提供了新的治疗靶点。此外，该纳米结构域可能影响癌症生物学，因为SPCA2促进乳腺癌进展，CFTR表达缺失与囊性纤维化中Wnt/β-catenin信号增强和肿瘤风险相关，ORAI1调节增殖和转移。了解Orai1/SPCA2相互作用可能因此揭示癌症的新治疗靶点。