缓症链球菌膜囊泡的功能特性：免疫调控与种间竞争的新视角

本综述系统探讨了缓症链球菌（S. mitis）来源的膜囊泡（MVs）在宿主-病原体互作中的多重功能角色。研究证实MVs可被肺泡上皮细胞内化，调控巨噬细胞与中性粒细胞的细胞因子（如TNF-α、IL-8、IL-6等）分泌，并显著抑制吞噬活性。同时发现MVs能选择性抑制牙周致病菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）的生物膜形成，揭示了其在口腔微生态调控与系统感染中的双重作用，为新型疫苗和抗生物膜制剂开发提供了理论依据。

　　

引言背景

口腔共生链球菌作为早期定植菌，通过过氧化氢产生、细菌素分泌和竞争性黏附等机制参与口腔微生态平衡的维持。缓症链球菌（Streptococcus mitis）作为口腔和咽部正常菌群的关键成员，可通过表面黏附素附着于人口腔黏膜细胞和唾液膜。虽然通常表现为低毒力，但其进入血液后可能引发菌血症和感染性心内膜炎，尤其在中性粒细胞减少的癌症患者中具有高危险性。该菌携带多种与肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）同源的毒力因子基因，如肺炎溶素（Ply）和自溶素，提示其潜在致病机制。

近年来，革兰氏阳性菌膜囊泡（Membrane Vesicles, MVs）的研究日益受到关注。与革兰氏阴性菌的外膜囊泡（OMVs）不同，MVs源于细胞膜，具有独特的 cargo 组成。肺炎链球菌 TIGR4 株可分泌富含胞质蛋白、跨膜蛋白及多种毒力因子的MVs，这些囊泡在鼠类模型中展现抗感染保护活性，并能诱导人类树突状细胞产生炎症细胞因子（IL-6、IL-8、TNF-α）。基于MVs的免疫原性和生物稳定性，它们已成为无细胞疫苗的候选者。然而，对于口腔共生链球菌如缓症链球菌是否产生MVs及其功能角色，此前尚不明确。

材料与方法

研究采用密度梯度超速离心法从缓症链球菌培养上清液中分离纯化MVs。通过粒径分析仪测定囊泡粒径，透射电子显微镜（TEM）观察形态特征，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析。采用人肺泡上皮细胞系A549和人单核细胞系THP-1，分别评估MVs的内化能力及对吞噬功能和细胞因子分泌的影响。此外，研究还分析了MVs对口腔致病菌（变形链球菌和伴放线聚集杆菌）生长及生物膜形成的调控作用。

结果

选择性生产MVs的口腔链球菌种类

研究确认八种测试链球菌菌株中有四种可产生MVs，包括肺炎链球菌TIGR4和三种缓症链球菌（NCTC12261、Nm-65、Nm-76）。而缓症链球菌SK142、血链球菌ATCC10556、戈登链球菌SK7和唾液链球菌HHT未检测到MV产生，表明MV生成能力存在菌种和菌株特异性差异。纯化MVs的蛋白电泳显示其条带模式与全细胞提取物及培养上清明显不同，提示MV形成涉及蛋白质的选择性包裹。

粒径分析显示所有产MV菌株的囊泡尺寸相对一致，平均直径在102.6–115.5 nm之间。TEM观察进一步证实了囊泡形态的均一性。MV产量计算显示TIGR4最高（119.5 MVs/CFU），缓症链球菌菌株间产量存在显著差异（Nm-65: 26.4 MVs/CFU; Nm-76: 61.7 MVs/CFU）。

链球菌MVs的全面蛋白质组学特征

蛋白质组学分析揭示MVs主要包含胞质蛋白（53.9%–61.6%），其次为跨膜蛋白（23.4%–41.4%）、脂蛋白（0.6%–4.6%）、细胞壁蛋白（1.6%–4.1%）和分泌蛋白（0.7%–1.7%）。在肺炎链球菌TIGR4的MVs中鉴定出659种蛋白质，包括已知的膜蛋白如唾液酸ABC转运蛋白SatA、丙酮酸氧化酶SpxB，以及毒力因子如肺炎溶素（Ply）、锌金属蛋白酶（Zmp）和自溶素。MV形成不依赖于Zmp表达，因zmpA、zmpB、zmpC缺陷突变体仍能产生MVs。

三种缓症链球菌菌株的MVs分别包含706、809和440种蛋白质，其中均富含可与膜相关脂磷壁酸中胆碱残基相互作用的胆碱结合蛋白。值得注意的是，Nm-65和Nm-76的MVs中含有与Ply同源的新型胆固醇依赖性溶细胞素，而NCTC12261缺乏该同源物，表明Ply并非MV生成所必需，这一结论在mitilysin（Ply同源物）缺陷的Nm-65株中得到进一步验证。

上皮细胞对链球菌MVs的胞吞作用

PKH67荧光标记的MVs与A549细胞共孵育后，共聚焦显微镜观察显示所有测试MVs（来源TIGR4、NCTC12261、Nm-65、Nm-76）均能被细胞有效内化，荧光信号定位于 actin 染色层（红色）内部。Z-stack成像证实囊泡位于细胞内而非仅附着于细胞表面。尽管观察到细胞摄取现象，显微镜检测未发现细胞脱落或细胞毒性迹象，荧光信号可持续约三天。

链球菌MVs对吞噬作用的抑制

将经人血浆或含MVs人血浆预处理的缓症链球菌SK142与PMA分化的THP-1巨噬细胞共孵育，发现所有来源的MVs均能显著降低吞噬活性（抑制率达90.1%–93.0%）。不同来源MVs产生的抑制程度相似，提示可能存在共同的作用机制，如通过囊泡表面蛋白干扰补体介导的调理作用或吞噬细胞识别过程。

免疫细胞对MVs的差异化细胞因子反应

MV刺激THP-1巨噬细胞后，多种细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α）的分泌呈现上升趋势，而IL-1α、IL-2、IL-12、IL-18水平未见显著变化。在DMSO分化的HL-60中性粒细胞中，MVs显著诱导IL-8产生，但TNF-α释放低于检测限。尽管缓症链球菌MVs诱导的细胞因子产量略低于TIGR4 MVs，但所有MV来源均呈现相似的应答模式，表明其具有共享的免疫调节机制。

MVs对口腔细菌生长及生物膜形成的影响

MVs对两种口腔致病菌表现出物种特异性效应。对于变形链球菌（Streptococcus mutans），MVs基本不影响其生物膜形成或细菌生长，甚至在高浓度（10 μg）Nm-76 MVs处理下表现出轻微促进生长效应。相反，所有测试MVs均以浓度依赖性方式促进伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa）的生长，但来自TIGR4和Nm-65的MVs在最高浓度（10 μg）下显著抑制Aa生物膜形成。这种生长促进与生物膜抑制的分离效应提示MVs可能含有特定的抗生物膜因子，且该作用具有菌株特异性。

讨论

本研究首次证实缓症链球菌可产生具有生物活性的MVs，并系统阐述了其在宿主-病原体及菌间互作中的多功能角色。MV生成能力的菌株差异性可能受遗传背景或环境因素调控，如化学限定培养基（CDM）高葡萄糖条件可诱导血链球菌、戈登链球菌和唾液链球菌产生MVs，提示培养条件对MV生物发生的重要影响。

蛋白质组学分析显示MVs富含胆碱结合蛋白，其中肺炎链球菌PspC可通过结合补体调节因子H干扰替代途径激活，从而抵抗补体介导的杀伤。缓症链球菌MVs可能通过类似机制促进菌血症期间的细菌存活，进而参与感染性心内膜炎等并发症的发生。

MVs通过TLR2信号通路和NLRP3炎症小体激活介导免疫细胞应答，其中脂磷壁酸和脂蛋白作为TLR2激动剂可能发挥关键作用。MV介导的免疫调节具有双重性：一方面增强炎症细胞因子分泌以招募免疫细胞，另一方面抑制吞噬功能促进细菌存活。这种平衡可能影响感染结局是从清除转向系统性传播。

MVs对口腔细菌的调控作用呈现物种特异性。对Aa生物膜形成的抑制效应（尤其见于TIGR4和Nm-65 MVs）与生长促进效应的分离，提示MVs可能作为缓症链球菌在密集定植的口腔生态位中的生存策略。鉴定其中特异性抗生物膜因子将为针对牙周病原体的新型治疗策略开发提供方向。

结论

缓症链球菌来源的MVs通过调控宿主免疫应答（抑制吞噬、诱导特定细胞因子分泌）和影响口腔致病菌生物膜形成，在多层面参与宿主-微生物互作。其免疫原性和生态调控功能为基于MVs的新型疫苗（尤其是针对易感人群的菌血症预防）和抗生物膜制剂的开发提供了理论基础。这些发现不仅深化了对链球菌致病机制的理解，也为靶向MVs的精准干预策略开辟了新途径。