婴儿配方奶粉铁含量降低与乳铁蛋白补充对口腔微生物组影响的随机对照试验

本研究通过一项随机对照试验，探讨了低铁（2 mg/L）及添加乳铁蛋白（Lf，1 g/L）的婴儿配方奶粉对4、6和12月龄婴儿口腔微生物组的影响。结果显示，配方奶粉组间微生物组成未见显著差异，但母乳喂养婴儿在6月龄时表现出较低的物种丰富度和独特的微生物结构。研究提示，调整铁含量和Lf补充对模拟母乳的微生物调节作用有限，为优化婴幼儿营养提供了重要参考。

　　

引言

母乳喂养不仅为婴儿提供营养，还在降低感染风险、促进胃肠道微生物群成熟等方面发挥关键作用。全球范围内，6月龄内纯母乳喂养率仍低于50%。在无法实现纯母乳喂养时，婴儿配方奶粉成为重要替代品。然而，当前配方奶粉与母乳在成分上仍存在显著差异，尤其是铁含量较高（通常为8–14 mg/L）而乳铁蛋白（Lactoferrin, Lf）含量较低。

母乳中铁含量约为0.1–1.6 mg/L，Lf则是其主要蛋白质成分之一。为更贴近母乳成分，LIME项目尝试在婴儿配方奶粉中将铁含量从8 mg/L降至2 mg/L，并添加1 g/L的牛乳铁蛋白（与人类Lf有69%的序列同源性）。已有研究表明，2 mg/L铁含量可满足健康婴儿的铁需求，而牛Lf的添加对婴儿铁状况、生长和免疫健康无负面影响。

口腔微生物组作为胃肠道的起始部分，在生命最初两年中逐步成熟，并受到喂养方式、出生方式、遗传因素及抗生素使用等多种因素的影响。母乳喂养婴儿通常表现出较低的α多样性，且含有更多有益菌属（如乳酸杆菌）。本研究作为LIME试验的子研究，旨在评估低铁及Lf补充配方奶粉对婴儿在4、6和12月龄时口腔微生物组成的影响。

方法

研究设计与受试者

LIME项目是一项随机双盲干预研究，在瑞典的健康婴儿中开展，婴儿在6±2周龄时被随机分至三组：对照组（Ctrl）接受铁含量8 mg/L的标准配方奶粉（n=36）；实验组一（Lf+FeLow）接受铁含量2 mg/L并添加1 g/L牛Lf的配方奶粉（n=72）；实验组二（Lf?FeLow）接受相同低铁配方但不添加Lf（n=72）。此外，设立母乳喂养参考组（BM，n=72）。所有组别在性别和出生年龄上相匹配。

样本量基于主要结局指标（6月龄时的铁蛋白和细胞因子水平）的检验效能计算。唾液样本在4月龄（n=244）、6月龄（n=216）和12月龄（n=229）时采集，最终保留668份样本进行后续分析（测序读数≥10,100）。

唾液样本处理与测序

使用改良的抽吸装置采集唾液样本，保存于-80°C直至DNA提取。DNA提取采用商业试剂盒（GenElute? Bacterial Genomic DNA kit），并进行质量检测。通过Oxford Nanopore Technology对16S rRNA全长基因进行扩增和测序，引物为27F和1492R，覆盖V1–V9可变区。测序数据使用Emu流程进行处理，分类参考扩展版口腔微生物组数据库（eHOMD）。

数据分析

除描述性统计外，研究还通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘回归（OPLS/OPLS-DA）探索微生物组的聚类模式。α多样性通过观察物种数、香农多样性指数和皮卢均匀度指数评估；β多样性通过Bray–Curtis相异度指数评估。使用线性回归调整混杂因素（如分娩方式），并通过火山图筛选关键差异物种。

结果

研究对象特征

各组婴儿在性别、胎龄和分娩方式上无显著差异。配方奶粉喂养的婴儿在6月龄时体重和身长显著高于母乳喂养组，其他人口学特征相似。

微生物组测序概况

在668份样本中，共鉴定出350个分类单元，包括234个命名物种和116个未命名分类单元，分属12个门和98个属。核心微生物组（所有婴儿中共有的物种）随年龄增长而扩大：4月龄为9个，6月龄为17个，12月龄达33个。约40%的物种在4月和6月时在所有喂养组中共有，到12月时这一比例升至65%。

喂养方式对微生物组的影响

PCA模型显示各组间解释力较低（R2=13–14%），未呈现显著聚类。OPLS模型在4月和6月龄时具有统计显著性（R2=17–26%, Q2=15–21%），显示母乳喂养婴儿在4月和6月时微生物组成与配方奶粉喂养组存在区别，但到12月时差异消失。

在6月龄时，母乳喂养婴儿的α多样性（物种丰富度和香农指数）显著低于所有配方奶粉组（p<0.001）。低铁配方喂养婴儿的均匀度（皮卢指数）高于对照组（p=0.036）。Bray–Curtis分析显示，配方奶粉组内差异小于配方奶粉与母乳组之间的差异（p<0.001）。

铁含量与Lf的单独效应

在比较低铁配方（Lf+FeLow和Lf?FeLow合并）与对照组时，物种丰富度无显著差异，但低铁组的均匀度更高（p=0.036）。OPLS-DA模型识别出若干与铁含量和Lf补充相关的差异物种。例如，低铁配方与Alloscardovia omnicolens的富集相关（p<0.001），而对照组与Streptococcus infantis和Granulicatella adiacens等相关。

Lf补充的影响较弱且不稳定。在Lf+FeLow与Lf?FeLow的比较中，虽有一些物种呈现差异（如Anaerolinea thermophila和Prevotella melaninogenica），但模型预测价值较低（Q2为负值）。

讨论

本研究未能证实低铁和Lf补充配方对婴儿口腔微生物组整体结构有显著影响。尽管在α和β多样性指标上观察到一些差异，但物种组成在配方奶粉组间高度相似。这与LIME主试验的结论一致，即干预措施对生长、免疫指标和铁状况无持久影响。

母乳喂养婴儿在6月龄时显示出更低的物种丰富度和更独特的微生物组成，这与既往研究一致。母乳中的生物活性成分（如Lf、低聚糖）可能促进益生菌生长并抑制机会致病菌。

配方奶粉中高铁含量（8 mg/L）可能导致某些细菌过度生长，从而降低物种均匀度。然而，本研究中铁含量降至2 mg/L并未引起微生物组成的重大改变，说明该铁浓度仍足以支持多数细菌生长。

牛Lf的添加未能显著改变微生物组，可能与其剂量（1 g/L）、与人类Lf的结构差异以及在配方奶粉加工过程中的活性损失有关。此外，研究人群为健康婴儿，其基线风险较低，也可能减弱了干预效果。

结论

降低铁含量和添加乳铁蛋白对婴儿口腔微生物组的影响不明确，仅发现铁含量降低对物种均匀度有轻微效应。配方奶粉喂养与母乳喂养婴儿之间的微生物差异在6月龄时最为明显，但随着辅食引入和年龄增长逐渐减弱。本研究为婴幼儿配方奶粉的优化提供了微生物学层面的证据，但提示需进一步探索其他母乳成分（如低聚糖）对微生物组的调节作用。