内质网应激耐受性受铜依赖性PERK激酶活性调控的新机制

本研究解决了PERK激酶活性调控机制不明的关键问题。研究人员通过多学科方法发现PERK是铜依赖性激酶，其活性受细胞内铜稳态调节。该发现揭示了铜-PERK调控范式可决定内质网应激结局，为治疗神经退行性疾病和癌症提供了新靶点。

　　

在细胞的生命活动中，内质网作为蛋白质合成和折叠的重要场所，其稳态维持至关重要。当各种应激因素导致未折叠或错误折叠蛋白质在内质网中积累时，就会引发内质网应激。为了应对这种应激，细胞进化出了未折叠蛋白反应（UPR）这一精密调控系统。其中，PKR样内质网激酶（PERK）作为UPR的关键传感器，通过磷酸化真核起始因子2α（eIF2α）来调控蛋白质翻译，在决定细胞命运中扮演着双重角色——既能促进生存，又能诱导凋亡。

然而，科学界长期面临一个难题：究竟是什么因素决定了PERK在促进生存和诱导凋亡之间的微妙平衡？尽管已知PERK信号需要精确调控，但其具体的分子调控机制仍不明确。这种认知缺口严重阻碍了针对PERK的治疗策略开发，特别是在癌症和神经退行性疾病等领域。以往试图靶向PERK的研究得出了矛盾的结果，有些情况下抑制PERK有益，而在另一些情况下则加重病情。这种矛盾性暗示着存在未知的调控因子在影响着PERK的活性窗口。

正是在这样的研究背景下，Sarah E. Bond Newton等研究人员在《Cell Reports》上发表了他们的最新发现，揭示了铜离子作为一种新型的PERK调控因子，为解决这一长期难题提供了新的视角。

研究人员综合运用了结构生物学、生物化学、细胞生物学和模式生物等多种技术方法。研究采用了HEK293F细胞表达系统进行蛋白纯化，通过谷胱甘肽pull-down实验、细胞热转移分析（CETSA）和体外激酶测定等技术证实PERK与铜的直接相互作用。利用CRISPR/Cas9技术构建了PERK铜结合位点突变体，并通过线虫模型进行功能验证。研究还使用了蛋白质印迹、ELISA和LDH细胞毒性测定等方法评估细胞反应。

PERK binds copper near the kinase active site

研究人员首先通过序列比对发现PERK与已知的铜结合激酶MEK1/2和ULK1/2具有高度相似的铜结合序列特征。通过谷胱甘肽pull-down实验，他们证实了PERK能够与铜特异性结合，且这种结合是直接的，不需要细胞中介物的参与。研究人员进一步确定了组氨酸935（His 935）和甲硫氨酸991（Met 991）是PERK铜结合的关键残基，并构建了相应的铜结合位点突变体（PCM1和PCM2）。通过AlphaFold结构预测和细胞热转移分析，他们发现这些突变虽然不影响蛋白质整体结构稳定性，但显著降低了PERK与铜的亲和力。

Copper is required for PERK kinase activity in vitro

在证实PERK与铜结合的基础上，研究人员通过体外激酶实验发现铜对于PERK激酶活性是必需的。使用ELISA和蛋白质印迹检测磷酸化eIF2α（p-eIF2α）水平，他们发现铜螯合剂TTM和BCS能够剂量依赖性地抑制PERK活性。更重要的是，PCM2突变体完全丧失了激酶活性，而PCM1突变体则表现出可变但降低的活性。这些结果表明铜结合与PERK激酶活性之间存在直接关联。

Copper is necessary and sufficient for PERK-eIF2α phosphorylation in the cell

将研究发现推向细胞水平，研究人员发现细胞内铜可用性能够特异性调控PERK活性。使用铜螯合剂处理细胞显著抑制了由PERK激活剂（PA）和毒胡萝卜素（Tg）诱导的eIF2α磷酸化。相反，使用铜离子载体Cu-ATSM处理则足以在无应激条件下诱导eIF2α磷酸化。这些效应在PERK敲除细胞中不出现，证实了铜对PERK的特异性调控作用。

Copper homeostasis dictates PERK signaling and ER stress tolerance

研究人员进一步探索了铜稳态对PERK信号和内质网应激耐受性的生理意义。通过比较CTR1（铜进口蛋白）敲除和ATP7A（铜出口蛋白）敲除的MEF细胞，他们发现细胞内铜水平能够双向调控PERK活性和应激结局。铜缺乏细胞表现出基础应激状态升高但应激反应受损，而铜过载细胞则表现出增强的PERK活性和应激耐受性，尽管有凋亡信号激活但仍能维持细胞存活。

PEK-1-copper mutant animals have impaired in vivo ER stress tolerance

最后，研究人员在线虫模型中验证了PERK-铜调控范式的生理相关性。通过CRISPR技术构建了铜结合位点突变的pek-1突变株，他们发现这些突变体在ire-1基因敲除或衣霉素处理条件下表现出严重的发育缺陷和应激敏感性增强。表型严重程度与突变数量呈剂量反应关系，PCM2突变体与pek-1完全敲除动物表型相似，进一步支持了铜结合对PERK功能的重要性。

研究结论和讨论部分归纳了铜-PERK调控范式的重要意义。研究人员提出了一个双部分模型：一方面，PERK铜占据率与激酶活性呈线性关系；另一方面，PERK铜占据率（从而激酶活性）与内质网应激反应和耐受性之间存在立方关系。这种复杂的调控关系解释了PERK信号的双相性质和在疾病中的矛盾作用。

该研究的发现具有多重重要意义。首先，它揭示了铜作为一种新型的PERK调控因子，为解决PERK靶向治疗中的矛盾结果提供了机制解释。其次，它建立了金属离子稳态与内质网应激反应之间的直接联系，为理解多种疾病的病理机制提供了新视角。特别是在神经退行性疾病和癌症中，铜代谢异常和内质网应激都是常见的病理特征，这项研究为两者之间的关联提供了分子基础。

此外，研究还暗示了其他eIF2α激酶可能也受到铜调控，特别是PKR，因为它保守了关键的铜结合残基。这扩展了我们对细胞内铜信号网络的认识，提示可能存在一个更大的"铜激酶组"。

从治疗角度，这项研究建议评估铜稳态可能为判断PERK靶向治疗的适宜性提供依据，而操纵细胞内铜可用性本身可能成为一种治疗策略。特别是在威尔逊病、癌症和神经退行性疾病等铜代谢异常疾病中，针对PERK-铜轴的治疗干预可能具有重要价值。

总之，这项研究不仅揭示了PERK活性的新调控机制，还为理解细胞内铜信号网络提供了重要见解，为未来治疗干预策略的开发奠定了坚实基础。