DNA损伤检查点平衡二倍体与多倍体来源的阻滞失败权衡

本刊推荐：为解决DNA损伤检查点如何协同最小化细胞分裂错误的问题，研究人员开展单细胞成像与模拟研究，发现G1/S和G2/M检查点强度存在权衡关系：增强一个检查点会减少一种错误类型但增加另一种。结果表明，检查点系统通过允许二倍体源和多倍体源错误以次优频率共存来实现总错误最小化，这对维持基因组稳定性具有重要意义。

　　

当细胞遭遇DNA损伤时，一套精致的监控系统——DNA损伤检查点系统——会启动并阻止细胞分裂，为DNA修复争取时间。这套系统主要通过G₁/S和G₂/M两个检查点发挥作用，前者阻止受损细胞进入DNA复制期(S期)，后者阻止受损细胞进入有丝分裂期(M期)。尽管这两个检查点的重要性毋庸置疑，但它们如何协同工作以最小化细胞分裂错误，即"阻滞失败"，仍是一个未解之谜。阻滞失败会导致基因组不稳定性，这是癌症等疾病的标志性特征之一。

为了解决这个问题，Kotaro Fujimaki、Ashwini Jambhekar和Galit Lahav团队在《Cell Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们发现，在中等程度DNA损伤下，细胞会通过两种主要途径发生分裂错误：一条途径涉及有丝分裂跳过(mitotic skipping)和后续的内复制(endoreplication)，另一条途径涉及直接从G₂/M检查点逃逸。令人惊讶的是，这两种途径产生的细胞在倍性、核形态和微核组成方面都截然不同，而且加强一个检查点虽然能减少一种错误类型，却会加剧另一种错误类型，揭示了一个内在的权衡关系。

研究人员主要采用单细胞长期活体成像技术、机器学习辅助的核分割与分类方法、计算机模拟以及分子生物学实验方法（包括免疫荧光、EdU检测、PNA-FISH和细胞周期扰动实验）来开展研究。使用的细胞模型为 immortalized 非癌性人视网膜上皮细胞系(hTERT RPE-1)。

核形态学揭示两种截然不同的阻滞失败微核化细胞

通过机器学习辅助的图像分析管道，研究人员能够精确区分初级核(PN)和微核(MN)。他们发现，在中等剂量DNA损伤下，发生微核化的细胞其核不规则性评分(irregularity score)存在显著差异。主成分分析(PCA)和聚类分析将这些细胞分为两簇：1型细胞(低不规则性评分、较少MN、主要为2C DNA含量)和2型细胞(高不规则性评分、高度微核化、大初级核、主要为4C DNA含量)。这两种类型在不同DNA损伤剂处理下均存在，且其丰度在2 Gy照射后6天相当。这表明阻滞失败的微核化细胞可分为两种主要类型，且其出现频率相近。

阻滞失败表型在分裂后立即出现但在分裂前已 predetermined

通过活细胞成像追踪表达核定位标记蛋白的细胞，研究发现微核化和核变形在细胞分裂后立即出现。姐妹细胞的不规则性评分高度相关，表明阻滞失败的类型在母细胞分裂前就已决定。在用CDK4/6抑制剂帕博西尼(palbociclib)或MDM2拮抗剂nutlin-3预处理细胞以诱导G₁期阻滞后，DNA损伤不再引起核变形和微核化，证实了分裂与这些特征之间的因果关系。

有丝分裂跳过、内复制以及多倍体细胞的后续分裂产生2型细胞

由于2型细胞主要为4C DNA含量且分裂后立即出现，其前体应为8C多倍体细胞。活细胞成像显示，一部分细胞确实经历了有丝分裂跳过(表现为geminin降解但无有丝分裂)、进入G₀/G₁阻滞，并在延迟后重新进入细胞周期进行内复制(geminin重新积累)，最终分裂产生微核化细胞。这条通路更多起源于损伤时处于S/G₂期的细胞，与更高的p21诱导和更长的分裂完成时间相关。从8C多倍体母细胞分裂产生的子代细胞表现出更高的核不规则性。着丝粒FISH分析显示，与核未变形的细胞(富含1型)相比，核变形的细胞(富含2型)其微核中含有着丝粒信号的比例更高，这与多倍体分裂易发生染色体错误分离的已知特性一致。这些结果表明，两种主要的阻滞失败表型由分裂母细胞的细胞周期历史和倍性决定。

产生2型细胞的多倍体源于具有4C DNA含量的G₀细胞

通过同时检测内源性Cdt1、Geminin和脉冲标记的EdU，研究人员推断出导致多倍化的细胞周期时相转变。轨迹推断分析显示，在损伤后一天内，细胞从G₂期转变为一个非常规的Cdt1阳性、Geminin低表达状态，进而进入一个缺乏Cdt1和Geminin的4C G₀状态(该状态也缺乏标记增殖细胞的磷酸化Rb)。在2天或更长时间后，部分4C G₀细胞转变为≥8C的多倍体状态。这表明产生2型细胞的多倍体细胞源于G₂细胞，这些细胞先转变为4C G₀状态，然后才进行内复制。

检查点严格性平衡二倍体源性和多倍体源性阻滞失败类型之间的权衡

为了理解DNA损伤检查点系统如何共同影响两种阻滞失败表型，研究人员建立了一个计算模型。该随机马尔可夫链模型模拟了细胞在细胞周期各时相间的转换概率，这些概率受DNA损伤和检查点活动的影响。模型预测，无论检查点严格性如何，阻滞失败的比例在中等DNA损伤水平下最高，这与实验观察一致。然而，总阻滞失败的程度可通过检查点的强度(Kd)调节。模拟显示，加强G₂/M检查点会减少二倍体源性的1型错误，但会增加多倍体源性的2型错误；而加强G₁/S检查点则减少2型错误但增加1型错误，揭示了一种权衡关系。模型预测，总错误最小化需要G₂/M检查点处于次最大强度，而G₁/S检查点处于最大强度，这或许解释了为何非癌性细胞中G₂/M检查点的激活阈值高于G₁/S检查点。

实验验证支持了这一权衡预测。抑制G₂/M检查点激酶ATR(使用VE-821)减少了4C G₀细胞(激活G₂/M检查点的副产品)，增加了总微核化细胞，但 specifically 增加了2C未变形的1型错误细胞，减少了4C变形的2型错误细胞。相比之下，在损伤前或损伤后1天沉默p53(同时影响G₁/S和G₂/M检查点)均增加了总微核化，但损伤后沉默(相较于损伤前沉默)导致1型错误减少而2型错误加剧，因为延迟抑制给予了细胞时间进行有丝分裂跳过而非强迫其带着损伤进行分裂。

讨论与结论

这项研究揭示了DNA损伤检查点系统功能中的一个基本权衡：G₁/S和G₂/M检查点的强度对二倍体源性和多倍体源性阻滞失败(Type 1 vs. Type 2)具有相反的影响。G₂/M检查点通过ATM/ATR依赖的机制阻止细胞进入有丝分裂，防止1型错误，但持久的阻滞也会通过p53-p21轴诱导有丝分裂跳过，在G₁/S检查点存在漏洞的情况下，这可能导致内复制并最终产生2型错误。G₁/S检查点则通过限制二倍体细胞(包括1型错误细胞)进入多倍体群体来抑制2型错误的产生，但同时允许1型错误持续存在。

研究表明，非癌性人类细胞在应激下发生多倍体分裂可能比通常认为的更普遍。虽然在一个时间点上8C细胞看似罕见，但由于内复制时间的异质性和8C细胞分裂后回归4C，这是一个低估。这些多倍体分裂的足迹——叶状核的形成——在轻度DNA损伤后更为明显。

研究结果表明，DNA损伤检查点系统并非通过完全阻止任一错误途径，而是通过平衡检查点活性，允许两种错误以有限的频率发生，从而实现总错误的最小化。这种平衡可能解释了为何在DNA损伤的"金发姑娘区"(Goldilocks Zone)，正常细胞会产生数量相当的二倍体和多倍体源性阻滞失败细胞。这两种错误类型的长期命运可能不同，但能够增殖的罕见细胞可能分别导致近二倍体和近四倍体癌症的发生。对DNA损伤检查点系统这种权衡关系的深入理解，可能为定向干预细胞命运、实现理想的治疗结果提供新的策略。