基于核苷酸基序的机器学习策略筛选血浆microRNA作为创伤早期诊断与病理预测的新型生物标志物

本刊推荐：创伤后复杂的病理生理反应导致高死亡率，但缺乏早期预测工具。研究人员通过机器学习算法鉴定出5个与促炎miRNA相关的核苷酸基序，据此筛选出12个血浆miRNA标志物。研究发现这些标志物在创伤患者中显著上调，与损伤严重程度评分(ISS)、器官损伤、凝血异常、内皮激活和炎症反应密切相关，AUROC显示其具有优异的诊断和预测能力。特别值得注意的是，miR-224-5p和miR-145-5p能有效区分创伤和脓毒症。该研究为创伤后病理生理变化的早期预测提供了新的分子标志物和见解。

　　

创伤是全球范围内导致死亡的主要原因之一，尤其对于1-44岁的人群更是头号杀手。尽管临床救治技术不断进步，但严重创伤后的高死亡率仍然令人担忧，这很大程度上归因于创伤后复杂的病理生理反应导致的继发性器官损伤。当前创伤治疗主要依赖于支持性疗法和对个体病理生理的针对性处理，但由于患者在人口统计学、损伤原因、潜在病理生理反应和治疗反应方面存在高度异质性，其伤后临床轨迹往往难以预测。这些挑战凸显了对能够预测这些关键病理生理反应工具的需求，如创伤后的炎症风暴、凝血病、内皮病和器官损伤等。

创伤会迅速激活先天免疫和修复机制以限制损伤，但当初始损伤严重且持续时，先天免疫激活可能变得严重失衡，驱动过度的炎症反应、内皮激活和损伤、细胞屏障功能障碍以及凝血病。在无感染的情况下，损伤细胞释放的危险相关分子模式(DAMPs)被认为是通过模式识别受体维持和加剧先天免疫系统持续激活的推定驱动因素，从而导致过度炎症、凝血、内皮病和器官损伤。因此，形成了组织损伤的前向反馈循环，导致炎症进而引起进一步的细胞和器官损伤。

近年来研究发现，在创伤和脓毒症等各种危重状态下从血浆、组织和细胞中分离的细胞外RNA是强大的先天免疫激活剂。血浆RNA测序显示，细胞外microRNAs(ex-miRNAs)是血浆小RNA的主要生物型，在创伤患者中显著差异表达，展示了创伤中血浆miRNA的独特特征。循环血浆miRNA谱据报道可以区分人类脓毒症和全身炎症反应综合征(SIRS)。miRNAs是小的单链(ss)非编码RNA，主要通过结合靶mRNA来调节细胞内基因表达，导致mRNA降解和翻译抑制。然而，越来越多的研究表明，miRNA也存在于细胞外空间，包括循环系统和各种体液中。这些细胞外(ex)无细胞miRNA被包装成各种血浆大分子复合物携带，包括EVs、高密度脂蛋白(HDL)和Ago-2。一些（并非所有）ex-miRNA可以作为DAMP通过结合和激活Toll样受体7(TLR7)并诱导先天炎症而发挥作用。在危重疾病如创伤和脓毒症中，ex-miRNA已被提出作为先天免疫反应和器官损伤的关键驱动因素，并作为潜在的创伤生物标志物。

在这项研究中，研究人员开发了一种计算机穷举搜索算法，识别出五个专门存在于促炎miRNA序列中的核苷酸基序。这些核苷酸基序用于识别和预测ex-miRNA促炎特性的效用并在两套独立的miRNA集中得到了验证。基于新一代RNA测序数据并以新发现的五个核苷酸基序为指导，研究人员筛选出了一组12个血浆miRNA作为创伤生物标志物候选物。在一个包含48名创伤患者的队列中，研究人员发现这些miRNA生物标志物的血浆浓度在入院时显著上调，与患者的损伤严重程度评分(ISS)以及广泛的血浆病理生理标志物密切相关的，这些标志物与器官损伤、凝血、内皮激活和炎症有关。此外，miRNA生物标志物在创伤患者的整体创伤严重程度、器官损伤、凝血、内皮激活和炎症方面表现出强大的诊断和并发预测能力。

研究人员采用了几个关键技术方法：首先通过计算机穷举搜索算法结合机器学习方法鉴定促炎miRNA的核苷酸基序；使用RNA测序技术分析创伤患者血浆miRNA表达谱；采用数字PCR(dPCR)技术精确量化血浆miRNA表达水平；利用Luminex多重检测系统同时测量14种与创伤病理生理相关的蛋白标志物；最后运用随机森林模型等机器学习方法评估miRNA标志物的诊断和预测性能。研究队列包括48名创伤患者和24名健康对照，所有样本均在创伤中心入院时采集。

机器学习引导发现miRNA中的促炎基序

为了识别专门嵌入促炎而非非炎性miRNA中的核苷酸基序，研究人员开发了计算机穷举搜索算法并采用机器学习方法进行自动基序选择。他们首先生成了一个包含33个小鼠miRNA的训练数据集，这些miRNA在创伤小鼠血浆中上调。通过体外细胞系统测试，其中18个miRNA模拟物触发了剂量依赖的CXCL2产生，而另外15个则没有。利用搜索算法，研究人员从33个miRNA的训练集中识别出了513,599个可能的基序，范围在2聚体到10聚体之间。通过排除那些出现在非炎性miRNA中的基序、在少于25%的促炎miRNA中出现的基序以及重复基序，将基序列表缩短至306个。最后，通过使用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)回归模型开发了自动基序发现算法，识别出了五个与训练集中18个促炎miRNA特异性相关的基序：UUC、U..UU.、.A.....UU.、G.UU.和UU...U。这五个基序在训练集中的敏感度为56-61%，特异度为100%，而五个基序组合使用时能够以100%的敏感度和100%的特异度区分促炎和非炎性miRNA。研究人员还在两个独立的miRNA集中验证了算法，结果显示五个基序组合在测试集1中达到92%的敏感度和86%的特异度，在测试集2中达到84%的敏感度和69%的特异度。

核苷酸基序指导的促炎miRNA生物标志物选择

基于发表的RNA测序数据，研究人员首先确定了创伤反应中上调的血浆miRNA。在人类血浆中检测到的401个miRNA中，有151个在创伤患者中上调，fold-change(FC)>1.5。然后他们选择了在创伤血浆中上调最明显且丰度最高的miRNA，应用基序发现算法对前38个miRNA进行分析，最终筛选出12个至少拥有一个促炎基序的miRNA作为生物标志物候选物。

血浆miRNA生物标志物在钝性多发伤患者中显著升高

使用dPCR技术在扩大的创伤队列(n=48)和健康对照(n=24)中测量血浆无细胞miRNA生物标志物候选物。研究发现所有12个miRNA候选物在创伤患者中高度表达且显著上调，与健康对照相比，fold-change范围从6.7(let-7c-5p)到78.2(miR-145-5p)。这种上调程度是损伤严重程度依赖性的，在严重损伤患者(ISS>15)中，12个miRNA生物标志物候选物中有10个表现出显著高于中度损伤患者(ISS≤15)的血浆水平。热图分析显示创伤患者在其12个miRNA生物标志物的相对血浆表达方面高度异质，但一些创伤患者，特别是许多ISS>15的严重损伤患者，显示出12个miRNA生物标志物的全面上调。

血浆miRNA生物标志物与创伤损伤标志物密切相关

为了捕捉创伤反应状态，研究人员设计了一个广泛的中介和损伤标志物面板，这些标志物与创伤病理生理敏感相关。使用Luminex多重检测系统测量了入院时血浆中存在的14种此类内型标志物，包括各种器官损伤标志物、促凝血剂、促炎细胞因子和趋化因子以及内皮激活标志物。研究发现脑损伤标志物S100B和烯醇化酶、肺损伤标志物ANG2/ANG1、纤维蛋白降解产物D-二聚体、血浆促凝血剂P-选择素和组织因子、促炎介质IL-6、TNFα、IL-8和CXCL2以及内皮细胞激活和损伤标志物 syndecan-1、vWF-A2和VCAM-1均显著增加。Spearman相关分析显示，在创伤队列中，12个miRNA生物标志物面板中的大多数与各种血浆蛋白损伤和炎症标志物中度或强相关，如脑损伤(S100B和烯醇化酶2)、凝血(P-选择素、组织因子和D-二聚体)、炎症(IL-6和IL8)和内皮损伤标志物(syndecan-1、vWF-A2)。

血浆miRNA生物标志物与天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶、乳酸和损伤严重程度评分相关

入院时的标准和常规临床血液检测为了解创伤病理生理提供了关键信息。结果显示创伤队列在早期仅表现出有限的继发性器官损伤，AST和ALT两个肝损伤标志物升高，血清乳酸升高组织缺血和 anaerobic代谢的敏感指标。大多数创伤患者仅表现出正常的凝血功能，PTT、PT和INR正常，肾功能正常，肌酐和BUN正常。虽然白细胞计数在受伤患者中异常高，但血小板和血红蛋白保持正常。与保持在正常范围内的临床损伤标志物不同，对于在入院时升高的损伤标志物，miRNA生物标志物表现出密切的相关性，包括AST/ALT、乳酸，以及与WBC的一定程度相关。重要的是，除了miR-224-5p和let-7c-5p未表现出严重程度依赖性升高外，miRNA生物标志物与患者的整体损伤严重程度评分(ISS)密切相关的。

使用miRNA生物标志物预测创伤病理生理反应

在一个包含34名创伤患者和17名健康对照的队列中，随机森林模型表明，12个miRNA生物标志物面板能够以交叉验证的受试者工作特征曲线下面积(CV AUROC)为0.98来区分创伤和健康组。当使用对照组损伤标志物值的上98%作为分类器时，miRNA面板在识别各种创伤损伤标志物方面表现出强大的性能，包括脑损伤、凝血、炎症和内皮激活，各自的CV AUROC值分别为0.90(烯醇化酶2)、0.97(S100B)、0.85(P-选择素)和0.86(D-二聚体)、0.97(IL-6)、0.93(IL-8)以及0.96(VCAM-1)和0.97(vWF-A2)。这些模型的预测性能在一个单独的创伤(n=14)和健康(n=7)队列中也得到了进一步验证，同样获得了高的CV AUROC值。作为比较和阴性对照，年龄和性别等人口统计学因素表现较差，CV AUROC在0.55-0.67之间。对于创伤队列中未改变或仅轻微升高的一些损伤标志物，如肺损伤标志物ANG1和ANG2、组织因子、TNFα和syndecan-1，miRNA生物标志物面板的表现不如上述标志物。

研究人员还评估了12个miRNA面板在区分重度和中度损伤方面的预测性能。CV AUROC值对于严重损伤(基于损伤严重程度评分(ISS)>15)为0.72，对于严重脑损伤为0.83(烯醇化酶2)和0.91(S100B)。同样，对于肝损伤的CV AUROC值为0.84(ALT)、0.79(AST)，对于炎症为0.70(IL-6)和0.67(IL-8)。对于代谢性酸中毒为0.72(乳酸)，对于凝血指标D-二聚体为0.71。作为参考的年龄和性别与各种器官损伤的正常和严重程度无关，AUROC值接近0.5，表明它们在创伤损伤标志物预测中表现不佳。miRNA生物标志物面板的严重程度预测模型在验证集中的表现类似。相比之下，miRNA生物标志物面板在区分创伤队列内的凝血因子(P-选择素、组织因子、PTT、PT、INR)、内皮细胞激活标志物(syndecan-1和VCAM-1)和肺损伤标志物(ANG1和ANG2)水平方面表现较差，可能是由于缺乏显著的创伤后反应或严重程度依赖性增加。最后评估了ISS是否能区分定量损伤标志物的严重程度，结果表明ISS在区分脑损伤严重程度(烯醇化酶2，AUROC=0.70)、血浆乳酸(0.74)、D-二聚体(0.80)和IL6(0.71)方面取得了部分成功。

miRNA生物标志物面板在创伤与脓毒症中表现出疾病特异性性能

研究人员测试了12个创伤miRNA生物标志物面板在创伤和脓毒症队列中的性能。发表的血浆小RNAseq结果显示，在创伤和脓毒症队列中上调的212个miRNA中，只有51个(24.1%)是两组共有的，而100个(47.2%)是创伤队列独特上调的。具体来说，12个miRNA生物标志物在创伤患者中显著上调，但在脓毒症患者中仅轻微上调。创伤和脓毒症队列中血浆miRNA的数字PCR量化证实了它们在创伤队列中的优先上调。基于12个miRNA面板的主成分分析(PCA)显示创伤和脓毒症患者之间存在部分分离，表明存在不同的分子特征。相比之下，使用常规生物标志物(如IL-6、组织因子和乳酸)的PCA无法区分两个患者组，因为它们的表达模式大部分重叠。值得注意的是，12个miRNA面板的第一主成分(PC1)解释的方差(64.4%)显著大于常规生物标志物面板(45.9%)，表明miRNA面板在创伤和脓毒症之间提供了更强大的区分信号。

接下来评估了两种miRNA——miR-145-5p和miR-224-5p——在创伤与健康对照队列中的预测能力。这两种miRNA在识别创伤方面的CV AUROC分别为0.88和0.98，而在脓毒症中的CV AUROC值显著较低，分别为0.68和0.56。同样，对于通过脑损伤、凝血、炎症和内皮细胞(EC)激活的各种损伤标志物测量的器官损伤预测，miR-145-5p和miR-224-5p在创伤中的表现一致更好，CV AUROC值显著高于脓毒症队列。相比之下，IL-6在创伤和脓毒症队列的诊断和器官损伤中显示出相似的预测CV AUROC值。组织因子在创伤和脓毒症诊断及器官损伤中表现出中等至弱的预测性能。

最后进行了ROC分析以评估这些生物标志物在创伤和脓毒症患者合并队列中的诊断性能，并与IL-6、TF和乳酸进行了比较。选择的miRNA——miR-224-5p和miR-145-5p——表现出强大的性能，CV AUROC分别为0.91和0.90，能够区分创伤和脓毒症患者。miR-224-5p用于区分创伤与脓毒症患者的cut-off值为1.8×10⁵拷贝/mL血浆，敏感度为85%，特异度为87%，而miR-145-5p的cut-off值为1.0×10⁷拷贝/mL，敏感度和特异度均为89%。重要的是，与这两种miRNA相比，IL-6、组织因子和乳酸在鉴别诊断方面的性能表现出显著较低的CV AUROC值。

研究结论表明，研究人员提出的概念验证表明，一组12个促炎miRNA——在创伤患者中丰富上调并在其序列中拥有特定核苷酸基序——可能作为创伤性损伤的生物标志物。这些miRNA与关键病理生理反应（如全身炎症、凝血和内皮激活）密切相关的，并显示出预测临床损伤严重程度和早期创伤反应的强大潜力，这一点通过多种敏感蛋白损伤标志物得到证明。这些发现支持了这样的观点：血浆促炎ex-miRNA及随后的先天免疫反应是分子驱动因素，可能负责创伤性损伤的一些关键病理生理反应，如炎症、凝血病、内皮激活和继发性器官损伤。与通常是非特异性且无法区分传染性和非传染性危重状况（如脓毒症和创伤）的下游病理生理相关的传统创伤生物标志物不同，这种基于核苷酸基序的机器学习策略提供了一种独特的方法，将miRNA序列与其促炎特性联系起来。结合RNA测序和血浆miRNA的数字PCR量化，核苷酸基序可考虑用于识别促炎miRNA，用于生物标志物选择和创伤及其他临床状况的潜在治疗干预，其中先天免疫激活和炎症是疾病发病机制的关键部分。

研究的局限性包括样本量相对较小，可能影响ROC分析和miRNA生物标志物预测性能的评估，需要更大规模的外部创伤队列来进一步测试miRNA生物标志物的效用以推广其临床应用。创伤患者严重程度相对 modest且无相关死亡率，虽然各种早期敏感标志物在初始创伤后显著增加，但大多数与器官损伤相关的临床参数（可能不太敏感）在采集血样时仍保持在正常范围内。缺乏纵向数据也是一个限制，虽然统计建模提供了关于这些miRNA生物标志物在识别创伤后并发病理生理反应能力方面的宝贵信息，但它们在预测未来继发性器官损伤方面的价值需要在纵向研究中进行测试。如果在前瞻性研究中得到验证，血浆miRNA生物标志物可能有助于识别在严重损伤后有继发性多器官损伤和不良临床结果（如凝血病和死亡率）风险的个体，并据此指导个体化临床创伤管理。