综述：核输出受体CRM1/XPO1及其多样货物

本综述系统解析了核输出受体CRM1（XPO1）的分子机制与生物学功能，重点阐述其通过识别核输出信号（NES）介导数百种蛋白质与多种RNA物种（如snRNA、mRNA、病毒RNA及rRNA）的核质转运过程。文章整合结构生物学发现，揭示CRM1与货物、RanGTP、核孔蛋白（Nups）的多价互作模式及变构调控机制，并探讨其在基因表达调控、疾病（如癌症）治疗靶点开发中的新兴角色。

　　

主要核输出受体CRM1

三十年前，四篇发表于《Cell》的论文及一篇综述推动了可溶性核转运因子的研究，这些因子介导蛋白质从核内输出。当时，这一研究得益于对leptomycin B（LMB）的鉴定——一种高效且选择性的核蛋白输出天然抑制剂。仅三年后，多个实验室鉴定出CRM1/XPO1（本文统称CRM1）作为主要核输出受体，其与携带核输出序列/信号（NES）的蛋白质相互作用。小GTP酶Ran在其GTP结合状态下，形成核内组装的CRM1-NES/货物-RanGTP三聚体核输出复合物的第三个组分。CRM1是与核孔复合物（NPC）相互作用的组分，负责将输出货物转运跨越NPC。通过后，Ran结合GTP的水解启动复合物解离，将货物释放到细胞质中。

CRM1的蛋白质货物谱

CRM1货物的鉴定得益于LMB等特异性抑制剂的可用性。超过400种个体蛋白质已被单独研究并报告为CRM1货物，这些信息已整合至多个数据库中。首批鉴定的CRM1货物——cAMP依赖性蛋白激酶抑制剂（PKI）和HIV-1 Rev蛋白——均携带短特征序列，即经典NES，其将蛋白质从核内靶向至细胞质。数百种蛋白质携带相关NES，许多已在数据库中注释。

此外，蛋白质组学研究已识别出数百种潜在CRM1货物，但尚未单独验证其与CRM1的直接结合。一种蛋白质组学方法中，经LMB处理的细胞被分馏以检测蛋白质的核积累或细胞质耗竭。其他策略包括识别结合固定化CRM1的总细胞提取物中的蛋白质，或使用BioID技术 proximity标记CRM1-BirA*附近的蛋白质。总体而言，这些蛋白质组学研究产生了约1600个候选货物，其中约270个得到至少两种方法的支持。部分单次命中可能因是CRM1的间接互作伙伴而被识别，这表明需要严格验证直接结合。

输出核外的货物类型包括：主动在核与细胞质间穿梭的蛋白质（如转录因子、肿瘤抑制因子或其他调控蛋白，其输入输出是控制基因表达的重要手段，常受翻译后修饰调节）；通过被动扩散进入核内或在有丝分裂后保留其中的蛋白质（可能对核区室产生有害影响，例如过氧化物酶体蛋白PEX19由CRM1主动输出）；以及可能以CRM1依赖性方式输出的非常小蛋白质或微肽（源自短非经典开放阅读框的许多此类肽可能与CRM1或其他转运受体相互作用）。总之，可溶蛋白质组中相当一部分受CRM1依赖性输出调控。

CRM1的RNA货物

大多数RNA物种（除mRNA外）以Ran依赖性方式输出，CRM1与专用适配蛋白常被用作输出蛋白。CRM1依赖性RNA输出的分子细节正逐渐被理解。

小核RNA（snRNA）

剪接体U小核RNA（snRNA）在核内转录并修饰有典型m⁷G帽结构，其被异二聚体CBP80-CBP20帽结合复合物识别。适配蛋白PHAX（磷酸化适配蛋白用于RNA输出）介导snRNA亚复合物与CRM1-RanGTP的相互作用。最近snRNA-PHAX-CBC-CRM1-RanGTP复合物的冷冻电镜结构显示，PHAX NES以典型CRM1-NES模式结合，并存在额外PHAX-CRM1、PHAX-Ran、CBC-CRM1和snRNA-CRM1相互作用。输出复合物所有组分间的广泛相互作用可能确保仅成熟snRNA复合物具备输出能力，避免无效转运事件。

细胞mRNA

大部分细胞mRNA输出通过Ran和CRM1非依赖性途径进行，使用NXF1-NXT1（酵母中为Mex67p-Mtr2p）作为转运受体。然而，若干个体mRNA使用CRM1进行高效输出。编码c-fos的mRNA是5'端带有m⁷G帽的RNA聚合酶II转录本，据报道通过CRM1输出。最初，RNA结合蛋白HuR被提议为适配蛋白，但后续研究未能证实此发现，且RNA输出复合物的组成仍不明确。这些发现引发其他细胞mRNA是否也由CRM1输出的疑问。主要细胞帽结合因子——真核翻译起始因子4E（eIF4E）——是一种多功能蛋白，在翻译和mRNA加工中发挥作用，并在核与细胞质间穿梭，提示其在mRNA输出中的作用，涉及LRPPRC（富亮氨酸 pentatricopeptide 重复蛋白）辅因子。LRPPRC与eIF4E及部分mRNA 3'非翻译区中的RNA元件相互作用，以RanGTP依赖性方式结合CRM1，可能作为某些mRNA核输出的适配蛋白。

HIV-1病毒mRNA

HIV-1的未剪接或部分剪接mRNA是首批鉴定的CRM1 RNA货物。这些mRNA需要HIV-1 Rev适配蛋白进行CRM1介导的输出。未剪接/部分剪接HIV-1 mRNA的结构化区域——Rev应答元件（RRE）结合Rev，而Rev NES结合CRM1。新近CRM1-Rev-RanGTP-RRE复合物结构将在下文讨论。Rev本身由完全剪接的病毒mRNA表达，通过NXF1-NXT1途径输出。

核糖体RNA（rRNA）

核糖体亚基是使用CRM1离开核的最大核糖核蛋白（RNP）颗粒。考虑到rRNA约占细胞总RNA的80%，rRNA复合物的输出涉及多种转运受体（包括CRM1和NXF1-NXT1 mRNA输出受体系统）并不令人惊讶。与其他RNP类似，CRM1介导的核糖体亚基输出也涉及适配蛋白，如大亚基的含NES蛋白Nmd3。最近对困于NPC通道内的酵母前60S颗粒的冷冻电子断层扫描研究检测到靠近L1 stalk（由25S rRNA和核糖体蛋白L1（Rpl1）形成的结构，其也结合Nmd3）的CRM1-RanGTP。除CRM1和Mex67p-Mtr2p外，作者在其结构中识别出若干其他潜在输出因子，引发其中哪个对转运最为重要的疑问。对前核糖体输出的单分子动力学研究表明，在哺乳动物细胞中，CRM1在大小核糖体亚基核输出中起主导作用，多个CRM1拷贝协同转运单个亚基。对于40S前核糖体颗粒，RanGTP结合蛋白Slx9和含NES蛋白Rio2已被证明促进CRM1依赖性输出。

转移RNA（tRNA）

tRNA经历非常复杂的生物发生途径，此过程在芽殖酵母中尤为复杂，涉及第一步核输出、胞质剪接后重新输入核内，以及进一步成熟形式的第二步输出。专用输出蛋白（如人细胞中的XPOT和酵母中的Los1）已被识别为tRNA输出蛋白。然而，XPOT/Los1在若干模型系统中非必需，提示其他tRNA核输出受体的参与。确实，一项主要基于共免疫沉淀实验的最新研究识别CRM1作为芽殖酵母中的tRNA输出蛋白。CRM1似乎偏好某些tRNA物种，但适配蛋白的身份仍不确定。

微RNA（miRNA）

初级miRNA似乎由exportin-5输出。然而，据报道LMB在不同模型生物中引起miRNA核积累，提示CRM1的作用。其他研究表明，一类miRNA的核输出不依赖exportin-5而完全依赖CRM1。一类不同类型的5'端帽miRNA据报道使用PHAX作为适配蛋白结合CRM1。类似于snRNA的原理可能适用于miRNA，以防止未成熟RNA物种的无效转运事件。

端粒酶RNA TLC1

在酵母中，端粒酶组分1（TLC1）——端粒酶的RNA组分——经历复杂生物发生：核内RNA聚合酶II依赖性转录、多聚腺苷酸化和加帽；输出至胞质后经历成熟步骤；重新输入核内；然后经外泌体依赖性修剪产生最终RNA。未成熟RNA的核输出似乎除mRNA输出因子Mex67p外还需CRM1。与snRNA类似，初始转录本的m⁷G帽招募CBC，但PHAX尚未被证明介导与CRM1的相互作用。

考虑到CRM1转运的多种不同RNA物种及巨大RNA质量，此输出蛋白可能 indeed被视为主要RNA输出因子。这些多样RNA配体大多据报道通过适配蛋白与CRM1相互作用，所有适配蛋白似乎都携带NES信号肽。

小核仁RNA（snoRNA）

snoRNA不进行核输出但在rRNA生物发生中具有功能。CRM1在snoRNA的核内运输中发挥作用，因其促进其从Cajal体向核仁的转运。与snRNA类似，snoRNA使用PHAX作为适配蛋白。

CRM1核输出机制概述

尽管货物多样，CRM1介导的蛋白质和RNA输出汇聚于依赖NES识别和RanGTP结合的共通机制。所有特征化CRM1货物（包括蛋白质和RNP）似乎使用8-15个残基长的NES（具有三或四个疏水氨基酸）结合输出蛋白。首批发现的NES（PKI, LALKLAGLDL; HIV-1 Rev, LPPLERLTL）含多个亮氨酸，产生早期术语“富亮氨酸NES”。后来清楚是疏水而非亮氨酸侧链驱动CRM1结合，且疏水残基模式高度多样。旧“富亮氨酸”描述现不必要地狭窄，此类输出信号简称为NES。此信号肽结合CRM1环中心凹面上的疏水沟槽。

CRM1使用其N端和C端HEAT重复结合RanGTP而非RanGDP。任何输出蛋白的标志是其对货物或RanGTP单独的低亲和力，仅当两者存在时才有高亲和力结合。此正协同性导致货物-CRM1-RanGTP输出复合物仅在RanGTP丰富的核内形成，并在GTP酶转化为GDP结合状态的细胞质中解离复合物释放货物。此变构机制的基础由蛋白质数据库（PDB）中90多个CRM1结构说明，显示CRM1在两种主要构象间切换：一种由未结合状态采用，另一种由NES和RanGTP结合稳定。

在核内组装后，货物-CRM1-RanGTP复合物与一部分Nups相互作用以转运跨越NPC至细胞质。在细胞质中，协同性也促进复合物解离：Ran结合GTP的水解（由RanGAP和RanBP1催化）触发RanGDP和货物释放。所得未结合CRM1被认为与Nups子集相互作用以穿越NPC返回核内进行另一轮输出。

通过NES识别的货物相互作用

NES-CRM1相互作用的首次结构洞察由2009年人CRM1结合货物Snurportin-1（SPN1）的晶体结构揭示。SPN1 NES（¹MEELSQALASSFSV¹⁴）结合CRM1沟槽于重复h11和h12。NES采用螺旋-链构象：残基1-12形成α-螺旋展示Φ-X₂-Φ-X₃-Φ-X₃-Φ模式（Φ=疏水，X=任意氨基酸），而残基12-14形成短β-链具Φ-X-Φ模式。SPN1 NES肽平行于CRM1螺旋h11A和h12A，其每个Φ₀、Φ₁、Φ₂、Φ₃和Φ₄疏水侧链占据沿沟槽的五个疏水口袋（P0-P4）之一。CRM1疏水侧链（形成口袋P1、P2和P3）的突变 abolished 与多个NES的结合，确立沟槽为NES结合位点。

后续对各NES疏水位置与其他疏水侧链的突变分析提示CRM1-NES相互作用的适应性。CRM1-NES结构显示许多NES肽在CRM1沟槽内采用螺旋-链构象。部分展示三个螺旋转角具四个疏水侧链结合CRM1口袋P0、P1、P2和P3，而其他仅形成两个螺旋转角，与口袋P1、P2和P3相互作用。其他NES展示更多样构象，包括延伸卷曲结构或完全螺旋形式。值得注意的是，部分NES以相反肽方向结合——反平行于螺旋h11A和h12A。NES序列的疏水模式与其结合构象相关，允许将 motifs 分类为11个 distinct 类别。尽管结合NES结构多样，CRM1沟槽保持相同开放构象以容纳各种NES结合模式。

NES肽可能以很大亲和力范围结合CRM1，从最紧结合PKI NES（K_D~30 nM）至最弱SPN1 NES（K_D~10 μM）。在此K_D范围内，核输出效率与CRM1结合亲和力线性相关。超出此范围，较低亲和力导致 abolished 核输出，较高亲和力产生“超”或“超生理”NES（无法从CRM1释放）。这些超NES不被高效输出并作为CRM1抑制剂，阻止其他NES货物结合和输出。

与CRM1相比，大多数其他输出蛋白和双向蛋白的货物特征化较少，有限结构数据提示这些Kaps识别折叠货物域而非线性信号序列。因此，多年来，CRM1识别的NES是唯一定义明确的输出信号类别。此观点最近随着酵母输出蛋白Msn5（exportin-5/XPO5同源物）识别 distinct 含磷酸丝氨酸输出信号的发现而扩展。此发现提示其他输出蛋白和双向蛋白可能也识别 falls outside CRM1 NES范式的 distinct 输出信号类别。定义这些识别原理将是理解核输出通路全多样性的关键。

NES之外的货物结合

NES肽以很大亲和力范围（数十纳摩尔至微摩尔）结合CRM1且弱结合物（如SPN1 NES, K_D~10 μM）相应弱介导核输出的发现提示，许多具弱NES的货物可能使用这些信号外区域结合CRM1以实现高效核输出。若干结构显示CRM1在NES之外与货物接合。

CRM1-SPN1复合物

除SPN1 N端NES结合CRM1沟槽外，全长SPN1也使用其核苷酸结合域和C端尾结合CRM1，导致纳摩尔亲和力紧密结合。SPN1 NES外的这些区域与CRM1 HEAT重复12-16相互作用。

CRM1-RanGTP-SUMO-RanGAP1-UBC9-Nup358复合物

RanGAP1在核与细胞质间穿梭，CRM1介导其核输出。CRM1-RanGAP1相互作用的功能有些复杂，因RanGAP1也是Ran调节因子（在输出复合物退出NPC时解离CRM1-RanGTP-货物复合物）。CRM1与RanGTP、SUMO-RanGAP1、UBC9和Nup358（也称RanBP2）复合物的新冷冻电镜结构 informs RanGAP1的两种功能。其显示一个CRM1分子在两个分离位点结合RanGAP1。RanGAP1 N端一个先前未检测到的NES结合CRM1的NES结合沟槽，而随后富亮氨酸重复GAP域结合RanGTP，且GTP酶结合Nup358的RBD4（Ran结合域4）。RanGAP1 SUMO缀合C端域（CTD）流动性大得多且仅在一小部分冷冻电镜颗粒中观察到，与CRM1的HEAT重复5-8相互作用。CTD也结合Ubc9和Nup358的串联IR1内部重复 motif 区段。结构也揭示了CRM1与Nup358中疏水残基相互作用的细节。

snRNA核输出复合物

CRM1-RanGTP-PHAX-CBP20/CBP80-加帽U1 snRNA结构呈现了snRNA核输出复合物的首视图。结构显示超出CRM1-PHAX NES相互作用的货物接触。PHAX的长25残基螺旋桥接CBP80和CRM1，其N端半部结合CBP80的疏水沟槽，C端半部为结合CRM1沟槽的PHAX NES。CBP20接触CRM1位点（邻近NES结合沟槽），且PHAX N端六残基区段结合CRM1的重复h5和h6。CRM1稳定PHAX-CBP20/CBP80复合物（结合加帽RNA）的构象，而RNA稳定PHAX（结合CRM1）的构象。RNA自身不接触CRM1。与下述HIV-1 Rev-RRE复合物类似，相互作用的复杂网络对于既产生足够结合能以形成稳定输出复合物，又防止未成熟中间物输出是必要的。

CRM1-Rev-RRE-RanGTP复合物

由CRM1和Rev-RRE复合物形成的核输出复合物显示两个CRM1-RanGTP复合物与一个Rev二聚体结合的大型不对称组装，后者又结合一个RRE RNA分子。为进一步稳定输出复合物，作者包括了Nup214的含FG片段（如先前所述）。两个CRM1-RanGTP复合物通过CRM1-CRM1相互作用（于凸面HEAT重复9和10处）二聚化。每个CRM1亚基结合来自Rev二聚体的一个NES，而Rev二聚体的 oligomerization 域横跨CRM1-CRM1二聚化接口结合两个CRM1亚基。结合RRE的Rev oligomerization 域将RNA导向一个CRM1环内部，以与CRM1及其结合RanGTP的碱性侧链相互作用。这是观察到的首个直接CRM1-RNA接口。尚不清楚此或其他CRM1表面是否可用于直接结合其他RNA或DNA物种。将CRM1-Rev-RRE转运 competent 组装保持在一起的复杂相互作用网络可能防止未成熟中间物输出。

上述多蛋白大型CRM1-货物组装显示，CRM1环托上许多不同表面可结合货物（除NES结合沟槽外）。类似地，核孔蛋白可与分布在整个CRM1表面的疏水斑块及可能其他区域相互作用。因此，CRM1所有21个HEAT重复可能用于接合其数百至数千种非常多样互作伙伴的集合。多位点货物结合可能提供开发不靶向CRM1普遍使用NES结合沟槽（如LMB和众多合成抑制剂）而是靶向与CRM1其他接口（对个体货物特异）的小分子抑制剂的机会。尚待研究是否存在完全缺乏经典NES并以非常个体化方式与输出受体相互作用的真实CRM1输出货物。此类货物的输出应依赖CRM1但可能对LMB不敏感。

CRM1的变构调控

潜在CRM1货物的庞大数量引发Ran依赖性CRM1结合和释放特异性如何实现的问题。未结合CRM1采用不利于货物和RanGTP结合的构象：NES结合沟槽关闭，且N端和C端HEAT重复处的RanGTP结合位点在空间上分离。此配置由h9内环（h9环）和C端尾稳定，其与形成沟槽背面的h11B和h12B螺旋相互作用。后一相互作用由h21螺旋的不寻常排列实现，其跨越CRM1环以固定尾部并在N端和C端间产生间隙。冷冻电镜结构显示这些末端区域灵活，可能有助于无货物时对RanGTP的低亲和力。

另一种由NES和RanGTP稳定化的CRM1构象解释了其观察到的协同性。此处，沟槽开放且能结合NES，而NES结合又稳定开放状态。从关闭到开放的切换由h9环和C端尾从沟槽背面释放 enabled。释放的h9环接合RanGTP，而h21螺旋重排为连接至N端重复的C端HEAT重复，完成高亲和力RanGTP接口。

单独RanGTP弱结合CRM1，且其稳定开放沟槽构象的能力也弱。类似地，货物/NES将CRM1切换至此状态的能力与其亲和力相关。例如，MVM NS2病毒蛋白的NES在存在RanGTP时以皮摩尔亲和力结合CRM1，且不需要GTP酶显示与CRM1的强结合。类似地，全长SPN1的高亲和力结合不需要RanGTP。然而，任一方（RanGTP或NES/货物）的存在使平衡偏向开放状态，促进另一方结合，此效应构成其正协同性基础。此原理不仅适用于NES，也适用于所有结合CRM1沟槽的配体。

许多小分子抑制剂靶向CRM1沟槽。共价抑制剂因长驻留时间特别有效于稳定开放沟槽，且可独立于RanGTP结合CRM1但仍将受益于GTP酶的存在。非共价抑制剂行为类似NES肽且应受益于RanGTP共结合。有趣的是，Cullin-RING E3连接酶底物受体ASB8（靶向CRM1降解）在NES沟槽内结合（位点不同于小分子抑制剂所用位点）。ASB8与RanGTP和/或沟槽结合抑制剂 exhibit 正协同性，进一步强调CRM1变构机制的多功能性。

在酵母中，RanBP1在细胞质中触发货物释放，为CRM1变构调控添加另一层。Ran结合RanBP1将CRM1的h9环从GTP酶置换，允许其重定位于NES结合沟槽背面并稳定关闭沟槽构象，促进NES释放。h21螺旋保持其HEAT重复排列，保留RanGTP相互作用。这些结构转变突出CRM1的多功能构象景观，并展示 distinct 配体（无论是货物、辅因子还是抑制剂）如何利用共通变构机制控制核输出。

结论与展望

三十年CRM1研究（包括深入结构分析）已使此输出蛋白成为最佳特征化核转运受体。对数百种互作伙伴（货物、核孔蛋白、调控蛋白甚至核酸）及其生物学的工作也推进了我们对许多细胞过程的理解。CRM1可能是具有最广转运能力的核转运受体，输出不仅蛋白质还有多样RNA-蛋白质复合物。超出其核输出核心角色，CRM1已被牵涉于基因调控和病毒复制等过程。尽管CRM1作为癌症治疗靶点的医学重要性得到公认，我们在此未聚焦此主题。未来针对CRM1与低、中、高亲和力结合伙伴的卓越多功能性研究将为更深入理解其机制及潜在开发高特异性治疗剂铺平道路。