模型驱动策略提升毕赤酵母β-甘露聚糖酶高效表达及其在棕榈仁粕降解中的应用研究

本研究针对棕榈仁粕（PKE）中抗营养因子半乳甘露聚糖限制其饲料化应用的问题，通过结合PMEPE模型与B因子分析理性设计β-甘露聚糖酶CsMan5A突变体，并利用细胞壁工程改造毕赤酵母表达系统，最终获得酶活高达147,597 U/mL、比酶活9010.81 U/mg的突变体Q7S，显著提升PKE降解效率与营养价值，为工业酶制剂开发与农业废弃物高值化利用提供创新策略。

　　

棕榈仁粕（Palm Kernel Expeller, PKE）作为棕榈油提取后的副产物，虽富含碳水化合物、氨基酸及微量元素等营养物质，但因含有高水平的抗营养因子——主要为β-甘露聚糖（galactomannan），其在非反刍动物饲料中的应用受到极大限制。β-甘露聚糖可干扰营养物质的吸收，降低饲料转化率，因此如何高效降解PKE中的甘露聚糖成为提升其饲用价值的关键。β-甘露聚糖酶（endo-β-1,4-D-mannanase, EC 3.2.1.78）能够随机水解甘露聚糖主链中的β-1,4-糖苷键，生成不同长度的甘露寡糖，从而消除抗营养效应。然而，现有酶制剂存在表达量低、酶活不足、热稳定性差等问题，难以满足工业化生产需求。

为此，来自中国科学院天津工业生物技术研究所的研究团队在《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》上发表了一项研究，通过计算生物学指导的蛋白质工程与宿主细胞改造，成功实现了β-甘露聚糖酶CsMan5A在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高效表达，并显著提升了其催化性能与稳定性，为PKE的高效酶法处理及饲料工业的绿色升级提供了有力技术支持。

该研究主要采用了以下几项关键技术方法：首先，基于深度学习框架构建了PMEPE（Predicting Mutations with Enhanced Protein Expression）模型，预测可提升蛋白表达的突变位点；结合B因子分析筛选潜在有益突变，并通过分子动力学模拟（GROMACS软件）评估突变体结构稳定性；利用基因敲除技术改造毕赤酵母细胞壁基因（PAS_chr1-3_0225与PAS_chr4_0305），增强蛋白分泌能力；最后通过高细胞密度发酵、酶学性质测定、动力学参数分析及PKE降解实验系统评估突变体性能。

3.1. 计算机预测与模型优化

研究团队利用PMEPE深度学习模型，对毕赤酵母中3914种蛋白的表达数据进行分析，筛选出14个可能提升CsMan5A表达的单点突变体。通过B因子分析进一步评估这些突变对蛋白结构动态性的影响，最终获得包括Q7S、Q229E在内的多个候选突变体。

3.2. 高密度发酵中重组CsMan5A及其突变体的表达

在5升发酵罐中进行高细胞密度发酵，结果显示突变体CsMan5A-Q7S的蛋白表达量达到16.38 g/L，较野生型提高17%，酶活达到147,597 U/mL，提高32.87%；比酶活为9010.81 U/mg，提高13.81%，为迄今报道最高值。

3.3. 重组β-甘露聚糖酶的酶学特性

纯化后的突变体Q7S最适温度为50°C，在70–90°C下表现出优于野生型的热稳定性。最适pH为5.0，在pH 5.0–9.0范围内稳定性良好。动力学参数显示，Q7S对底物LBG的V_max为7813.96 μmol·min^?1·mg^?1，催化效率（K_cat/K_m）显著提升。

3.4. CsMan5A-Q7S突变体稳定性提升的机制分析

分子动力学模拟表明，Q7S突变体的RMSD、RMSF和Rg值均优于野生型，说明其整体结构更稳定、柔性更优，关键催化区域波动更低，这与其提升的酶活性和热稳定性一致。

3.5. 通过工程化毕赤酵母提高蛋白分泌水平

敲除细胞壁相关基因PAS_chr1-3_0225和PAS_chr4_0305后，菌株生物量和蛋白分泌能力进一步提升。突变体CsMan5A-Q7S-Δ0225的蛋白产量提高至18.70 g/L，说明细胞壁改造可有效促进外源蛋白分泌。

3.6. 利用野生型与突变体β-甘露聚糖酶改善PKE品质

在酶用量为5000 U/mL时，突变体Q7S处理后的PKE残渣重量百分比最低（71.9%），粗蛋白含量提高至18.94%，粗纤维含量降至16.6%，显著提升了其作为饲料的营养价值。

研究表明，通过计算模型指导的理性设计与宿主细胞工程相结合，可显著提升β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达水平与催化性能。突变体CsMan5A-Q7S不仅具备优异的热稳定性和催化效率，还能高效降解PKE中的甘露聚糖，显著改善其饲料品质。该研究为工业酶制剂的开发提供了一条新路径，同时为农业副产物的资源化利用奠定了理论基础与应用前景。