综述：家畜高分化气道上皮细胞培养模型中呼吸道病毒感染模型的应用与局限性

本综述系统探讨了高分化气道上皮细胞（WD-AEC）模型在家畜呼吸道病毒研究中的前沿应用与核心局限。作者强调该模型在病毒宿主限制性、嗜性、复制动力学及先天免疫应答研究中的独特价值，尤其适用于高灵敏度野外毒株分离、病毒中和试验（VNT）和跨物种传播风险评估（如H5N1禽流感病毒对牛的感染性验证），同时指出其缺乏适应性免疫系统和高通量筛查能力的局限性，为替代动物实验提供了重要技术路径。

　　

引言

呼吸道病原体是全球家畜健康的重大威胁，常导致养殖业严重经济损失。家畜呼吸道疾病多由病毒和细菌混合感染引发，形成多因素病因的“呼吸道疾病复合体”。研究这些宿主-病原体相互作用传统依赖动物体内实验或体外细胞模型，而高分化气道上皮细胞（WD-AEC）模型的出现为在体外研究呼吸道病毒与宿主上皮细胞的直接互作提供了更接近生理状态的平台。该模型符合动物实验的3R原则（替代、减少、优化），尤其适用于研究病毒侵入、复制、宿主先天免疫应答及病毒致病机制。

高分化气道上皮细胞：从人类到家畜

WD-AEC可来源于原代呼吸道上皮细胞或气道类器官，通过气液界面（ALI）培养形成假复层黏液纤毛上皮结构，包含基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞。反刍动物和马的肺组织或鼻甲是细胞分离的常见来源，而猪因屠宰过程中的热水处理常需依赖实验动物来源。相比永生化细胞系，WD-AEC保留了体内上皮的极性、黏液分泌和纤毛跳动功能，且可通过类器官扩增大幅提高细胞产量（单只牛肺可生成高达8000个Transwell滤膜培养体系）。不同物种的培养条件需个性化优化，如细胞接种密度、生长因子浓度和滤膜孔径调整。

感染实验与病原嗜性

WD-AEC高度模拟体内呼吸道上皮的形态和功能，适用于病毒分离、毒力评估和宿主范围研究。例如，牛呼吸道合胞病毒（BRSV）野外毒株在WD-AEC中扩增后仍保持毒力，避免了细胞培养适应性突变。流感病毒可在WD-AEC中引起显著细胞病变，通过跨上皮电阻（TEER）测量和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可量化上皮损伤和纤毛丢失。副黏病毒如小反刍兽疫病毒（PPRV）需通过基底侧受体nectin-4感染，仅在上皮损伤（如划痕实验）后方可成功侵入，证实了体内感染机制。

宿主对感染的应答

WD-AEC可动态分析病毒感染后的先天免疫应答，包括趋化因子分泌和免疫细胞招募。通过定量RT-PCR、RNA测序或ELISA/multiplex技术可检测基因表达和细胞因子释放（如IL-6、IFN-β）。共培养模型（如肺泡巨噬细胞或血源免疫细胞）可通过3μm孔径滤膜实现免疫细胞向上皮迁移，但需注意培养方向（倒置培养可能导致渗漏）以模拟基底侧免疫细胞浸润过程。

其他潜在应用

WD-AEC支持多种创新研究：通过活细胞成像或CLSM可视化病毒侵入机制；评估病毒跨物种传播风险（如欧洲H5N1高致病性禽流感病毒对牛的感染性）；多重病原共感染或微生物组互作研究；野外毒株分离（如牛冠状病毒、猪副流感病毒1型）；使用野外毒株进行病毒中和试验（VNT）；以及抗病毒药物或疗法筛选（如针对病毒结合或释放的抑制剂）。

高分化气道上皮细胞的局限性

WD-AEC模型仍存在显著局限：培养过程耗时耗资且难以高通量化；缺乏适应性免疫系统、血流和器官级复杂性；结果需与动物实验数据比对验证；实验室间标准化挑战及供体/品种差异性。未来需通过“芯片肺”（lung-on-chip）等复杂模型提升生理相关性。

结论

家畜WD-AEC模型是研究病毒复制、细胞嗜性、物种屏障和宿主应答的强大工具，尤其适用于新发病毒风险评估和难培养病原的分离与中和试验。尽管其在预测毒力和宿主敏感性方面潜力显著，仍需与体内实验数据关联验证以充分发挥其替代动物研究的价值。