综述：植物微繁殖中微生物污染控制的现代与传统策略：当前见解与未来展望

本综述系统探讨了植物组织培养中微生物污染的控制策略，涵盖传统方法（热疗法、化学疗法、冷冻疗法）与新兴技术（纳米材料、植物源抗菌剂），重点分析了污染源、防控关键点及可持续解决方案，为农业生物技术（微繁殖、脱毒苗生产）和濒危物种保护提供了理论与实践参考。

　　

2. 影响植物组织培养的微生物病原体

植物组织培养系统中的病害表现与控制方式与大田栽培显著不同。实践者面临两大挑战：建立无病原体的初始培养物，并在整个繁殖过程中保持无菌状态。理想状态是完全生物纯净（无菌），但实践中难以确认，因此更常用“无菌”一词表示未检测到污染物。常见问题是环境微生物快速定植培养基，其生长速度往往超过植物组织。这些污染物被称为“体外病原体”（vitropaths），与田间特异性植物病原体不同。

植物in vitro繁殖的独特之处在于其应用范围广泛，包括克隆繁殖作物和研究不足的药用或观赏物种。这些植物可能来自植物病理学数据稀少的地区，增加了引入外来或认知不足微生物的风险。此外，组织培养不仅易受微生物入侵，还易受微小节肢动物侵染。

为消除表面微生物，化学灭菌被广泛采用，通常涉及用乙醇或次氯酸钠溶液清洗外植体，常添加表面活性剂以增强渗透。在更耐药的情况下，使用更强或替代的消毒剂。污染的主要来源是内共生微生物——那些存在于植物组织内部的微生物，而附生菌则定植于外部表面。从实践角度看，任何在灭菌步骤中存活并进入培养的微生物都被视为内共生菌。

部分内共生菌生长迅速且可见，另一些则保持休眠和未被检测状态，仅在培养条件变化时才被激活。这种潜伏可能导致在继代培养过程中出现未被注意的污染，造成材料损失或培养质量下降。某些内共生菌要求苛刻，需要特殊培养基生长，而其他包括不可培养的病毒和类病毒可能通过连续培养周期传递。

尽管一些细菌可能在早期培养基的激素平衡或渗透条件下被暂时抑制，但它们可以在根诱导阶段条件变化时重新繁殖。这种复苏可能通过传播受感染植物或降低繁殖成功率在商业繁殖系统中引起严重问题。在研究环境中，污染物可能损害旨在代谢物生产或转化研究的培养物，潜在改变目标化合物或通过微生物代谢物引入生物危害。这些隐藏污染物还可能通过例如将抗生素抗性基因转移至根癌农杆菌而干扰基因工程，使其更难从转基因品系中消除。

内共生菌涵盖多个微生物群——主要是细菌、病毒、类病毒，以及在较小程度上真菌。这些可能包括致病病原体、中性共生体或来自周围环境的微生物，包括已知对人类有致病性的菌株。虽然许多病原体表现出宿主特异性，使其更易追踪，但植物也宿主来自环境的机会性微生物，包括附生菌和来自如粪便等来源的残留病原体。这些相互作用通常遵循动态演替模式，受季节、作物生长阶段和农业投入的影响。

因此，组织培养可能容纳特定植物病原体、机会性入侵者和共生体的混合——通常具有不可预测的结果。除了内源来源，培养物还易受外部来源的二次污染，如空气传播微生物、实验室人员或继代培养过程中的操作错误。此类事件可能损害实验完整性和生产效率，特别是在大规模繁殖系统或生物技术应用中。

3. 植物组织和细胞培养中的关键控制点

植物组织培养程序通常分为几个不同阶段。污染风险存在于所有in vitro阶段；然而，特定微生物（如真菌、酵母，尤其是细菌）的进入往往因阶段而异。微繁殖工作流程中的每个阶段代表一个关键控制点（CCP），需要持续观察和调节以最小化微生物污染。

某些在特定阶段持续出现的微生物属可用作生物指标，帮助确定污染事件的时间和可能起源。根据潜在微生物入侵的严重性和影响，每个阶段分为两类：CCP I，监督不足可能破坏整个植物生产系统或实验室中的所有培养物；和CCP II，控制失误可能导致部分培养物损失。这些CCP分类专门为植物组织培养环境定制，不同于食品安全或制药环境中使用的类似术语。

4. 植物外植体中初始微生物污染的来源

在自然栖息地中，植物可能在外部和内部携带微生物。这些微生物包括植物病原体和可能作为附生菌或内共生菌持续存在的环境生物。一个称为“半内共生菌”的亚群发现于难以灭菌的植物区域，如叶基和腺体结构。此外，植物表面的微生物簇通常对常见消毒剂具有高抗性。虽然小感染因子如病毒和类病毒能够在植物组织内系统传播，但较大病原体如弹状病毒和某些细菌物种往往局限于维管系统。同时，其他微生物，无论有害或良性，通常栖息于发育细胞之间的空间，如叶肉组织。

叶片的最外层屏障——角质层——作为防止外部生物穿透植物气生部分的初级防御。然而，微生物仍可能通过风、昆虫造成的伤口或通过自然植物开口如气孔、皮孔或病原体创建的病变进入。一旦进入，它们可能定位于叶空气空间或中空茎腔中。随着植物成熟，这些内部空腔扩大，为微生物定植创造机会，特别是在茎和地下贮藏器官中。与芽不同，根通常缺乏保护性角质层，尽管有些具有木栓化细胞壁。内部木栓化内皮层有助于限制土传微生物进入维管系统。根毛区，位于生长尖端后方，由于周围土壤中密集的微生物种群，是微生物相互作用的热点。土壤微生物还可能入侵根皮层组织并形成共生关系——如豆类中的根瘤菌或大多数植物中的菌根。侧根出现或线虫和真菌活动造成的损害进一步增加了微生物渗透的风险。

宿主-病原体关系相对较好理解。病原体可能通过自然开口或物理力穿透宿主植物，并产生酶和毒素削弱植物防御。反过来，植物部署一系列防御——包括结构屏障、抗菌化合物和应激反应蛋白。疾病进展或宿主成功抑制病原体取决于这些相互作用的平衡。虽然涉及植物病原体的机制有详细记录，但对机会性微生物知之甚少。一些研究表明，甚至看似无害的细胞间细菌定植者也能引发宿主反应，类似于病原体触发的反应——如代谢物泄漏和应激信号。这可能意味着在某些条件下，植物防御在抑制内共生菌增殖中发挥作用。

根分泌物和侧根形成通常导致根内外微生物种群升高。表面灭菌技术可能在培养建立前未能完全消除这些微生物。因此，地下器官如根或块茎通常不是外植体的首选——除非它们含有专门研究的化合物。在这种情况下，彻底的微生物筛查至关重要。相比之下，植物的气生部分通常对微生物营养较少，因此更适于启动清洁的in vitro培养。植物组织内营养物质的可用性也在微生物定植程度中扮演重要角色。事实上，受损植物细胞的营养泄漏可以鼓励微生物在细胞间空间增殖。

由于这些原因，茎尖通常被选为建立清洁和无病原体组织培养的外植体。其他部分如节段携带与成熟组织类似的污染风险。即便如此，叶和茎外植体已在几种观赏物种中成功使用，如秋海棠和非洲紫罗兰，通常没有显著的污染问题。

某些真菌和细菌病原体拥有酶或机械策略直接穿透植物角质层或自然开口，定居于细胞间区域并在植物组织中传播。通过伤口或孔口进入的环境微生物通常保持局限于这些空间。感染植物维管系统的病毒和细菌病原体，如木质部或韧皮部相关物种，通常通过昆虫载体引入，并往往是系统性的。尽管分生组织培养有助于消除系统病原体，但污染仍可能在建立后发生，特别是由于实验室相关微生物或人为引入污染物。

5. 植物组织培养中污染的致病微生物

植物组织培养已成为产生均匀、无病种植材料的重要工具，可以全年生产。该技术在有性繁殖中特别有价值，目标是生产遗传 identical、无病原体的植株，适用于商业用途。其成功应用有助于增加食物可用性并为生产者和消费者带来经济利益。尽管有这些优势，污染仍然对通过in vitro方法进行作物繁殖的效率和可靠性构成严重威胁。

各种污染物——包括丝状真菌、细菌、酵母、病毒和微节肢动物如螨类和蓟马——已被确定为植物组织培养系统中的频繁入侵者。这些生物通常绕过标准灭菌程序。此外，微生物污染通常与培养基制备不当、外植体消毒不充分以及使用受污染仪器或工具有关。污染的后果是重大的，包括浪费时间、劳动力和材料，最终导致经济损失。

5.1. 细菌

细菌污染——特别是来自内共生和表面（叶圈）物种——是由于其在植物自然环境中的普遍性而成为组织培养中最具挑战性的问题之一。内部细菌，无论它们存在于细胞之间还是内部，都难以消除，因为表面灭菌方法无法有效到达它们。虽然这些细菌在田间可能无害甚至有益，但它们在无菌培养条件下的存在可能迅速变得有问题。

一些内共生菌为宿主植物提供优势，如增加抗病性或改善适应性，然而它们在微繁殖过程中的持续存在可能极具破坏性。使用系统性灭菌剂如氯化汞可能消除细菌但也会损害植物组织。在许多情况下，细菌污染在早期培养阶段未被检测到，仅在几轮继代培养后出现。虽然一些植株可能尽管污染继续生长，但长期暴露通常由于细菌增殖导致组织损伤和培养失败。

5.2. 真菌

真菌污染代表了成功微繁殖的另一主要障碍。真菌往往快速生长，经常超过缓慢生长的植物组织in vitro。它们的快速增殖导致 significant 资源损失，并可能负面影响培养生产效率。有效管理真菌污染物需要准确的物种鉴定。

真菌进化出保护机制以确保生存，例如在孢子周围形成胶囊以保护它们免受环境应激和宿主免疫反应。它们还部署细胞外酶和抗生素样化合物以抑制植物防御并促进感染。例如，镰刀菌 spp. 分泌脂肪酶促进定植，而曲霉 species 如黄曲霉产生酶包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶以支持宿主入侵。

除了感染性酶，真菌还释放解毒化合物——如酯酶、谷胱甘肽 S-转移酶、细胞色素酶和木质素降解酶——帮助它们抵抗化学灭菌剂。许多真菌物种产生并排泄次级代谢物，干扰植物细胞功能。这些化合物可以降解宿主组织，竞争营养，抑制植物免疫力，或导致生理应激，降低培养外植体的生存和活力。

6. 植物组织培养中污染的当前管理

植物组织培养中污染的当前管理涉及几种旨在消除微生物病原体和维持无菌条件的策略。关键方法包括化学疗法、热疗法和冷冻疗法，每种提供 distinct 方法来控制微生物污染。化学疗法使用化学剂根除病原体，而热疗法涉及应用热量以从培养中消除污染物。冷冻疗法则应用冷冻技术以管理微生物生长并增强植物组织的生存。本节将探讨这些方法在控制植物组织培养系统中污染的原理、应用和有效性。

6.1. 化学疗法

某些细菌属——如根癌农杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、丙酸杆菌、变形杆菌、假单胞菌、和葡萄球菌——已知是植物组织培养中的重要污染物，主要 due to 它们与