基于优化前处理的二维液相色谱法检测动物肝肾中胍类化合物及其代谢分布研究

本研究针对动物肝肾组织中高极性、低分子量胍类化合物(GCs)检测面临的灵敏度低、基质干扰强等难题，通过系统优化苯甲酰精氨酸乙酯(Benzoin)衍生化反应条件(100?°C/5?min, 30?mmol/L Benzoin+8?mol/L KOH)和蛋白沉淀试剂体系(50%甲醇-0.5%盐酸)，建立二维液相色谱-紫外检测(2D-LC-UV)方法，实现胍基琥珀酸(GSA)、胍基乙酸(GAA)和胍基丁酸(GBA)的精准定量，在5–500?μmol/L范围内线性良好(r2>0.99)，定量限达5?μmol/L，成功应用于小鼠和猪肝肾样本检测，揭示GCs器官特异性代谢分布规律，为动物能量代谢研究和疾病诊断提供关键技术支撑。

　　

在动物生理代谢过程中，胍类化合物(Guanidino Compounds, GCs)扮演着至关重要的角色。这类含氮代谢产物不仅参与能量代谢和氮平衡调节，还与多种疾病的发生发展密切相关。根据结构和功能差异，GCs主要分为三类：甲基化胍类（如甲基胍、二甲基胍）、胍基氨基酸衍生物（如胍基琥珀酸GSA、胍基乙酸GAA、胍基丁酸GBA）以及精氨酸及其代谢产物（如肌酸、肌酐）。其中，GAA作为肌酸合成的前体，在饲料中添加可促进肌肉生长和蛋白质合成，提高畜禽产肉产奶性能；GBA通过转化为丙酮酸和乳酸参与能量代谢；而GSA则被视为小分子毒素，在肝硬化和尿毒症患者血清及肝肾组织中显著升高，成为肝肾功能障碍的诊断标志物。

然而，由于GCs具有高极性、低分子量特性，主要以离子形式存在，且缺乏生色团或荧光团，导致传统光谱检测方法灵敏度不足。此外，生物组织中丰富的蛋白质会与GCs结合或与衍生化试剂反应，产生非特异性信号，严重干扰检测准确性。虽然衍生化技术可通过引入荧光基团提升检测灵敏度，但反应条件（温度、时间、试剂浓度等）和样品前处理流程的优化仍是技术难点。现有方法在复杂生物基质中往往存在回收率低、稳定性差等问题，难以满足精准定量需求。

为解决这些难题，湖南农业大学兽医学院的宁克明、周泉等研究人员在《Food Chemistry: X》上发表论文，通过系统优化衍生化反应条件和蛋白沉淀试剂体系，结合二维液相色谱技术，建立了检测动物肝肾组织中GCs的高灵敏度分析方法，并成功应用于实际样本检测，揭示了GCs的器官特异性分布规律。

本研究主要采用以下关键技术方法：通过正交实验优化苯甲酰精氨酸乙酯(Benzoin)衍生化反应参数（温度、时间、浓度）；比较不同有机溶剂（甲醇、乙腈、三氯乙酸等）的蛋白沉淀效果，确定最佳沉淀试剂；使用二维液相色谱系统（一维苯基柱、二维C18柱）实现在线富集和正交分离；以紫外检测器（315?nm）进行定量分析；方法学验证包括线性范围、检测限、精密度、准确度和稳定性评估；样本来源于ICR小鼠和市售猪的新鲜肝肾组织。

3.1. 样品前处理条件优化结果

通过正交实验确定最佳衍生化条件为100?°C反应5?min，苯甲酰精氨酸乙酯浓度30?mmol/L，KOH浓度8?mol/L。该条件下GSA、GAA和GBA的色谱峰面积最大，表明衍生化反应最完全。对比不同蛋白沉淀试剂（甲醇、乙腈、三氯乙酸等）发现，50%甲醇-0.5%盐酸溶液能有效沉淀蛋白质的同时保持GCs的提取效率，且峰形尖锐、信噪比高。甲醇的强极性有利于GCs溶解，而盐酸环境促进胍基质子化，减少与蛋白质的静电作用，抑制氧化或水解副反应。

3.2. 2D-LC系统在线富集与转移能力评价

系统在线富集能力评估显示，在10–100?μL进样体积范围内，目标化合物色谱峰无畸变或位移，表明方法具有良好的富集能力。转移回收率实验表明，GSA、GAA和GBA的平均转移回收率分别为94.07%、123.50%和119.08%，转移精密度RSD%均低于1.39%，证明系统在复杂生物基质中具有高稳定性和可靠性。

3.3. 2D-LC方法检测动物肝肾样本中GCs的评价

方法学验证结果显示，GSA、GAA和GBA在小鼠肝肾组织中的检测限(LOD)均为3?μmol/L，定量限(LOQ)为5?μmol/L，在5–500?μmol/L范围内线性良好（r2>0.99）。特异性分析表明，GAA和GBA的色谱峰无显著干扰，GSA在空白样本中虽有微量干扰峰，但强度仅为定量限信号的8%，不影响定量可靠性。精密度和准确度评估中，大部分化合物RSD%低于20%，准确度在78.77%–115.96%之间。虽然肾脏样本中部分GCs的RSD值较高（最高39.87%），可能与基质复杂性或内源性物质干扰有关，但整体方法仍满足生物样本分析要求。稳定性实验证实，样本在4?°C下6?小时内保持稳定。

3.4. 2D-LC方法的应用

应用优化后的方法检测小鼠和猪肝肾样本，发现GCs分布存在器官和物种差异。肝脏中GSA浓度最高（小鼠3.51±3.60?μmol/L，猪4.28±3.16?μmol/L），GBA最低；肾脏中GAA积累最少（小鼠0.01±0.02?μmol/L，猪0.12±0.19?μmol/L）。这种分布差异与器官特异性代谢途径有关：GSA作为精氨酸代谢中间产物，在肝脏中通过胍基乙酸甲基转移酶(GAMT)和精氨酸酶催化生成；GAA在肾脏中易被转化为肌酸或通过有机阳离子转运体排泄；GBA则可能在其他组织（如大脑、肌肉）中参与神经传递或能量代谢。

本研究通过优化衍生化条件和蛋白沉淀体系，建立了灵敏、可靠的2D-LC-UV方法，成功实现了动物肝肾组织中GSA、GAA和GBA的精准定量。方法学参数符合生物样本分析要求，并首次揭示了GCs在肝肾组织中的物种特异性分布规律，为研究动物能量代谢 homeostasis、肝肾疾病病理机制以及畜禽产品品质调控提供了重要技术支撑。未来可进一步结合质谱技术提升检测灵敏度，并拓展至临床诊断和营养调控应用领域。