多重PCR辅助实时纳米孔精准测序技术用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速现场鉴定

本刊推荐：本研究创新性地开发了多重PCR辅助实时纳米孔测序技术（multiplex PCR-assisted real-time nanopore sequencing），通过设计非重叠长片段引物组，在220分钟内实现从采样到结果输出的全流程检测，检测限达102 CFU/250mL。该技术突破了传统全基因组测序（WGS）耗时长、操作复杂的局限，为食品安全领域病原体现场快速鉴定提供了通用性解决方案。

　　

Highlight

材料与试剂

铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）CMCC(B) 10104购自安徽省产品质量监督检验研究院；大肠杆菌（E. coli）ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 27217、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）ATCC 14028、单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）ATCC 19111以及阪崎肠杆菌（E. sakazakii）ATCC 5132均购自安徽大学。模拟水样通过将菌株混入预先确认阴性的包装饮用水中制备。

多重PCR辅助实时纳米孔精准测序原理

该技术原理如方案1a所示。虽然第二代和第三代测序平台可作为病原体鉴定的金标准，但全基因组测序（WGS）通常需要1-2天才能获得结果，难以满足现场快速检测需求。本研究通过设计特异性长片段引物组进行多重PCR扩增，对目标片段进行末端修复和纯化后构建测序文库。纳米孔蛋白捕获的时变电流信号通过便携式测序设备实现实时序列解读，不同扩增子序列信息的相互验证可在10分钟内显著提升检测效率和准确性。

结论

本研究开发的纳米孔精准测序策略通过预多重扩增长片段显著提升DNA富集效率，优化组合的长扩增子使测序时间缩短至5分钟，检测灵敏度提高10倍。该方法无需预培养即可达到10² CFU/250mL的检测限，且可通过调整引物设计应用于其他常见细菌检测，为食品安全领域病原体快速鉴定提供了通用技术平台。