枯草芽孢杆菌分泌表达κ-卡拉胶酶MtKC16A及其在高效制备κ-卡拉三糖与抗氧化活性研究中的应用

本研究成功在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中实现κ-卡拉胶酶MtKC16A的分泌表达（酶活0.016 U/mL），创新性地结合酸解与酶解技术从κ-卡拉胶高效制备κ-卡拉三糖（κ3，得率47.0%），并首次揭示该寡糖具显著优于多糖的体外抗氧化活性，为奇数链卡拉胶寡糖（OCOSs）的绿色制备提供了新策略。

　　

¹Highlight²

³Materials⁴

实验材料：克隆宿主大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α购自北京Tsingke生物技术有限公司。质粒pMATE02s用于将目标基因导入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）宿主进行酶表达，购自天津ChunYao生物科技有限公司。表达宿主枯草芽孢杆菌MATE01感受态细胞同样购自天津ChunYao生物科技有限公司。用于产物分析的κ-卡拉胶（κ-carrageenan, KC）购自上海麦克林生化科技有限公司（上海，中国）。

⁵Secretory expression of MtKC16A in B. subtilis⁶

我们在质粒pMATE02s中插入了去除自身信号肽（SP）的MtKC16A编码基因，并将重组质粒pMATE-mtKC16A转化至枯草芽孢杆菌MATE01中进行酶表达。数据（未显示）表明MtKC16A在枯草芽孢杆菌细胞中成功表达。以pMATE-mtKC16A为模板，我们在MtKC16A编码基因的N端连接了七种不同的信号肽编码基因以实现分泌表达（图1a）。

⁷Conclusion⁸

结论：我们成功在枯草芽孢杆菌中构建了表达系统，实现了产κ-新卡拉四糖（Nκ4）的κ-卡拉胶酶MtKC16A的胞外分泌，酶活为0.016 U/mL。通过使用酸预处理的κ-卡拉胶（KC）作为底物，我们开发了一种通过分泌的MtKC16A高效制备κ-卡拉三糖（κ3）的方法。我们的结果表明，通过酸解和酶解相结合，从1克κ-卡拉胶中可以制备得到0.47 ± 0.01克κ3，其浓度为4.70 ± 0.10克/升。