基于胡桃科蛋白水解物活性肽数据库PWDB的抗氧化肽鉴定及其多靶点机制研究

本研究针对胡桃科加工副产物高值化利用需求，通过构建包含3894条高置信度肽段的PWDB数据库，结合分子对接与细胞实验筛选出WDPFE、FDPFP和WDPNY三种核心抗氧化肽，证实其通过协同作用Keap1、MPO、XO等多靶点显著缓解氧化应激，为功能性食品开发提供新策略。

　　

随着人们健康意识的提升，天然抗氧化剂在功能性食品和医药领域的应用需求日益增长。胡桃科植物（Juglandaceae）如核桃、山核桃和碧根果等，不仅是优质的油脂来源，其蛋白质资源同样具有极高价值。然而，当前胡桃科油脂加工过程中产生的大量副产物——如脱脂核桃粕——常被废弃或仅作为动物饲料使用，造成资源浪费。这些副产物蛋白质含量丰富（例如碧根果副产物蛋白质占比达39.35%），且氨基酸组成均衡，是开发生物活性肽的理想原料。

活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）过量产生是诱发慢性疾病的关键因素。传统植物抗氧化成分如多酚类、类胡萝卜素等已被广泛研究，而近年来，源于蛋白质的抗氧化肽因其高活性、易吸收等特点受到瞩目。尽管已有研究报道胡桃科蛋白水解物具有抗氧化潜力，但系统性、多物种覆盖的肽段数据库仍属空白，限制了高效筛选与机制探索。

为此，研究人员在《Food Chemistry》发表了最新成果，通过整合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术与生物信息学分析，构建了胡桃科活性肽专用数据库PWDB（Peptide Walnut Database），并从中筛选出具有显著抗氧化功能的核心肽段，结合分子模拟与细胞实验验证其多靶点作用机制。

研究主要采用以下关键技术方法：首先通过双酶解处理（DHT）和超滤（<3?kDa）制备胡桃科三种物种（山核桃Cc、核桃Jr、碧根果Ci）的肽段组分；利用纳流液相色谱- Orbitrap质谱平台进行肽段鉴定，并通过PEAKS Studio de novo（从头测序）算法解析序列；基于PWDB数据库进行虚拟筛选，结合毒性、过敏性、溶解性及自由基清除能力预测；采用AutoDock Vina进行分子对接分析，靶点包括Keap1（Kelch样ECH关联蛋白1）、MPO（髓过氧化物酶）和XO（黄嘌呤氧化酶）；通过合成肽段开展体外化学抗氧化实验（ABTS、FRAP、羟自由基清除）及Caco-2细胞模型评估氧化应激保护效应。

3.1. 抗氧化肽段组分CcPF、JrPF和CiPF的分离

通过超滤获得的<3?kDa肽段组分（CcPF、JrPF、CiPF）在ABTS自由基清除、铁还原能力（FRAP）及羟自由基清除实验中均显著优于完整水解物，证实小分子肽段具有更强抗氧化活性。细胞实验表明，三者均在100–200?μg/mL浓度下显著提升H₂O₂损伤的Caco-2细胞存活率并降低细胞内ROS水平。

3.2. 通过de novo sequencing鉴定肽段

基于LC-MS/MS共鉴定出3894条高置信度肽段（de novo评分≥95），其中核桃Jr贡献1624条，碧根果Ci1241条，山核桃Cc1029条，长度范围4–23个氨基酸，90.23%的肽段长度在10个氨基酸以内。

3.3. 胡桃科小肽数据库的构建

PWDB数据库整合了所有鉴定肽段的基础信息与理化性质，包括来源物种、修饰类型、生物活性评分等。氨基酸组成分析显示亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸含量最高，而甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸占比最低。修饰分析发现甲硫氨酸氧化、赖氨酸乙酰化和半胱氨酸烷基化为主要修饰类型。

3.4. 抗氧化候选肽的虚拟筛选

通过PWDB内置筛选流程，依次基于生物活性评分（>0.5）、非毒性、非致敏性、良好水溶性及自由基清除潜力，从3894条肽段中逐步聚焦至31条Jr肽段、34条Ci肽段和26条Cc肽段。进一步通过分子对接评估与Keap1、MPO、XO的结合能力，最终锁定三条碧根果来源肽段：WDPFE、FDPFP和WDPNY。

分子对接结果显示，WDPNY与Keap1结合能达-10.3?kcal/mol，形成7个氢键并与关键活性残基（Arg415、Ser555等）相互作用；FDPFP结合能为-9.8?kcal/mol，产生12个氢键和π-堆叠作用；WDPFE结合能为-9.6?kcal/mol，结合模式类似。三者与MPO、XO也呈现稳定结合，提示多靶点抗氧化潜力。

3.5. 候选肽的体外抗氧化能力

化学抗氧化实验显示，WDPNY的ABTS清除能力最强（>1.5?mmol Trolox/g），显著优于阳性对照谷胱甘肽（GSH）。细胞层面，三者均无显著细胞毒性，且能浓度依赖性地提升H₂O₂损伤的细胞存活率（WDPNY在400?μM时达86%）。ROS荧光检测表明，肽段预处理使ROS水平降低72.5%。此外，WDPNY和FDPFP显著提升超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，并降低丙二醛（MDA）含量，证实其通过增强内源抗氧化防御系统缓解氧化损伤。

4. 结论与讨论

本研究成功构建了胡桃科专属活性肽数据库PWDB，为高效挖掘功能性肽段提供资源平台。通过多层次筛选获得WDPFE、FDPFP和WDPNY三条核心抗氧化肽，其优势在于：①小分子量（621–693?Da）利于吸收；②末端芳香族/酸性氨基酸（W、Y、E）可能主导抗氧化活性；③多靶点结合Keap1、MPO、XO，模拟天然配体作用模式；④细胞实验验证其缓解氧化应激、提升抗氧化酶活的综合功效。

研究意义在于：首次系统性整合胡桃科多物种肽段资源，突破既往研究局限于单一物种的瓶颈；提出“数据库构建-虚拟筛选-实验验证”的高效发现模式，缩短研发周期；为胡桃科加工副产物高值化利用提供科学依据，推动天然抗氧化剂在功能食品中的应用。未来需进一步开展体内实验验证 bioavailability（生物利用度）及 gastrointestinal（胃肠道）稳定性，并探索工业化量产工艺。