Cry4Aa杀虫蛋白中非保守α4-His178对α4-α5发夹稳定性的关键作用及生物毒性机制研究

来自泰国的研究人员针对Cry4Aa毒素中His178残基在杀虫活性中的关键作用展开研究，通过定点突变、生物毒性测试和分子动力学模拟，发现His178通过与α5-His217形成氢键稳定α4-α5发夹结构，揭示了其维持膜插入能力和幼虫毒性的分子机制，为设计高效蚊虫控制毒素提供了新靶点。

　　

背景：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）Cry毒素以其杀虫特性闻名，主要通过α4-α5发夹结构形成离子泄漏孔。在针对蚊虫的Cry4Aa毒素中，螺旋4（helix 4）的His178被推测在其生物毒性中起关键作用。

方法：研究通过定点突变技术构建了10个His178替代突变体（H178D、H178E、H178K、H178R、H178G、H178F、H178Y、H178S、H178C和H178Q），并在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达。毒素溶解性在碳酸盐缓冲液（pH 10.0）中评估，生物毒性以埃及伊蚊（Aedes aegypti）幼虫为对象测试。胰蛋白酶处理后的毒素通过荧光染料释放实验分析，离子通道形成在平面脂质双层（planar lipid bilayers, PLBs）中研究，结构分析借助分子动力学（MD）模拟和与已知Cry毒素的序列比对完成。

结果：所有突变体均以130-kDa原毒素包涵体形式过表达，表达水平与野生型（WT）相当。将His178替换为非极性或大体积极性残基使生物毒性降至10%以下，而替换为小极性、中等极性或负电残基则保留50-85%活性，与其体外溶解性一致。选定的生物活性突变体H178C和H178D保留了膜扰动能力，与胰蛋白酶激活的WT类似，而生物无活性突变体H178Y则表现出膜通透性下降。所有测试突变体及WT均在PLBs中诱导出电导约为130-pS的阳离子选择性通道。序列-结构分析表明，Cry4Aa-His178可能与螺旋5中保守的His217形成氢键。

讨论：残基178的特定理化性质对最优杀幼虫活性至关重要，这使其成为设计更高效蚊虫控制毒素的潜在靶点。

结论：Cry4Aa-α4的His178可能与α5-His217形成稳定氢键，从而维持α4-α5发夹的结构完整性，该稳定性对高效膜插入和最优杀幼虫活性必不可少。

关键词：Cry杀虫蛋白（Cry insecticidal proteins）、螺旋发夹（helical hairpin）、氢键（hydrogen bonding）、幼虫毒性（larval toxicity）、膜扰动（membrane perturbation）、结构完整性（structural integrity）。