活性氧依赖的Jak2/Stat3通路激活在HBV诱导肝脏炎症中的关键作用及机制研究

本研究针对慢性乙型肝炎（CHB）中肝脏炎症发生的起始机制不明的问题，开展了关于HBV复制诱导线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能障碍及活性氧（ROS）积累通过Nrf2/IL-6/IL-8介导Jak2/Stat3信号通路激活的研究。结果表明，ROS依赖性Jak2/Stat3通路的激活是HBV诱导肝脏炎症发生的关键环节，为慢性乙型肝炎的发病机制提供了新的见解，并为临床干预提供了潜在靶点。

　　

慢性乙型肝炎（CHB）是全球性的公共卫生问题，据估计，全球有2.96亿人慢性感染HBV，每年约110万人死于HBV相关的肝硬化和肝癌。尽管大多数免疫正常的成人感染后可自发清除病毒，但仍有部分患者（特别是在婴幼儿期感染）会发展为慢性感染，经历从“免疫耐受期”到“免疫活动期”的转变。免疫耐受期患者病毒载量高、肝功能指标正常、肝脏无明显炎症；而免疫活动期则表现为肝功能异常（如ALT升高）、肝脏炎症加剧及纤维化进展。然而，触发这一转变的具体分子机制尚不明确。

传统观点认为，随年龄增长而增强的HBV特异性T细胞应答是导致免疫耐受突破的关键。但近年研究发现，处于免疫耐受期的儿童患者同样存在HBV特异性T细胞应答，且其功能并未显著受损，提示非特异性炎症反应可能在肝脏炎症的发生中发挥重要作用。肝脏转录组分析显示，在免疫活动早期，与健康对照或免疫耐受期患者相比，与炎症、先天免疫和细胞趋化相关的基因表达显著上调，而线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能相关基因则显著下调。线粒体作为细胞能量代谢和活性氧（ROS）产生的主要场所，其功能异常可能导致代谢紊乱和信号通路激活，进而参与炎症发生。然而，线粒体功能障碍是否以及如何触发HBV诱导的肝脏炎症，尤其是Stat3信号通路的激活，仍待深入探索。

为此，本研究旨在探究HBV复制是否通过诱导线粒体OXPHOS功能障碍和ROS积累，进而激活Jak2/Stat3信号通路，从而触发肝脏炎症。研究结果不仅有助于阐明CHB患者从免疫耐受向免疫活动期转变的机制，也为开发针对ROS相关通路的治疗策略提供了理论依据。本论文发表于《Genes》杂志。

为开展本研究，作者运用了多种关键技术方法，主要包括：利用HBV复制细胞系（HepG2.2.15和HepAD38）及小鼠模型（pAAV/HBV1.2 hydrodynamic injection模型）模拟HBV持续复制及肝脏炎症过程；通过Seahorse细胞线粒体压力测试、JC-1线粒体膜电位检测、ATP含量及线粒体复合物I/III活性测定评估线粒体功能；采用DCFH-DA和MitoSOX荧光染色检测细胞及组织中ROS水平；通过Western blotting和实时定量PCR（qPCR）分析信号通路关键蛋白及基因表达；利用ELISA和流式细胞术检测炎症因子水平及免疫细胞浸润；并结合人类公共数据集（GSE83148）进行GSEA富集分析验证表型。

hepatic transcriptome profiles revealed significant down-regulation of mitochondrial OXPHOS genes at the early phase of HBV-related hepatic inflammation

通过对HBV转基因小鼠及CHB患者肝转录组数据的分析，研究发现，在肝脏炎症早期，线粒体OXPHOS功能相关基因显著下调，尤其是复合物I和III的基因表达下降最为明显。与无明显炎症的阶段相比，炎症早期免疫/炎症相关通路显著富集，而OXPHOS等代谢通路则显著抑制，提示线粒体功能异常与炎症发生密切相关。

HBV replication induced mitochondrial OXPHOS disorders and ROS accumulation

在HBV复制的细胞系中，病毒持续复制导致线粒体呼吸功能受损，表现为氧消耗率（OCR）下降、膜电位降低、ATP含量减少及复合物I/III活性下降，同时伴随ROS水平显著升高。这些异常可通过抗病毒药物恩替卡韦（entecavir）处理部分逆转，表明HBV复制直接导致线粒体功能障碍及ROS积累。

HBV-induced ROS accumulation enhanced activation of the Jak2/Stat3 signaling pathway

HBV复制细胞中Jak2和Stat3的磷酸化水平显著升高，且下游炎症基因（如Saa1、S100a9、Icam1和Socs3）表达上调。通过增加（H₂O₂处理）或清除（Mito-TEMPO处理）ROS水平，可相应调控p-Jak2和p-Stat3的表达，证实ROS是Jak2/Stat3通路的上游激活因子。

Nrf2-induced cytokines communicated ROS to the activation of the Jak2/Stat3 pathway

ROS积累上调了核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达，进而促进IL-6和IL-8的产生。抑制Nrf2可降低IL-6/IL-8表达及p-Jak2/p-Stat3水平，而阻断IL-6或IL-8信号也能抑制Jak2/Stat3通路激活，表明Nrf2-IL-6/IL-8轴介导了ROS对Jak2/Stat3通路的调控。

Enhanced ROS levels with concurrent increased hepatic inflammation and activation of the Jak2/Stat3 pathway in HBV replication mice

在HBV复制小鼠模型中，肝脏炎症早期（注射后4周）伴随ROS水平升高、GSH/GSSG比率下降、Nrf2表达上调、IL-6/IL-8水平增加及Jak2/Stat3通路激活，同时肝脏炎症细胞浸润加剧，与细胞实验结果一致。

Scavenging ROS hindered activation of the Jak2/Stat3 pathway and alleviated hepatic inflammation in vivo

使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理HBV复制小鼠，可显著降低肝脏ROS水平、抑制Nrf2表达及Jak2/Stat3通路激活，减轻肝脏炎症和免疫细胞浸润，进一步证实ROS在触发肝脏炎症中的关键作用。

综上所述，本研究通过体内外实验证明，HBV复制通过诱导线粒体OXPHOS功能障碍导致ROS积累，进而通过Nrf2-IL-6/IL-8轴激活Jak2/Stat3信号通路，最终触发肝脏炎症反应。这一发现不仅揭示了HBV诱导肝脏炎症起始的新机制，也为临床干预提供了潜在靶点——靶向ROS或Jak2/Stat3通路可能有助于延缓CHB的疾病进展。此外，研究还提示线粒体功能异常可能是连接病毒复制与非特异性炎症的重要桥梁，为理解其他病毒性肝炎及代谢性肝病提供了新思路。