CLCA4通过抑制结直肠癌干细胞特性并增强抗PD-1免疫治疗提供新策略

本研究聚焦于氯离子通道辅助蛋白4（CLCA4）在结直肠癌干细胞（CSCs）中的调控机制及免疫治疗增敏作用。研究人员通过体内外实验发现CLCA4表达下调与肿瘤干细胞特性正相关，其过表达可通过与波形蛋白（vimentin）相互作用抑制FAK信号通路，从而降低CD133+CD44+ CSCs的自我更新能力。值得注意的是，CLCA4过表达能促进CD8+ T细胞浸润并显著增强抗PD-1疗法疗效，为微卫星稳定型结直肠癌的免疫联合治疗提供了新思路。

　　

在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）每年造成超过88万人死亡，已成为重大公共卫生问题。尽管诊疗技术不断进步，但肿瘤复发转移和治疗抵抗仍是临床面临的主要挑战。近年来，癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）理论为这一困境提供了新视角——这群具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群，被认为是肿瘤耐药、转移和复发的"罪魁祸首"。然而，如何有效靶向CSCs并改善免疫治疗效果，仍是当前研究的难点。

针对这一科学问题，来自温州医科大学附属第一医院胰腺癌研究中心的团队在《Genes》发表了重要研究成果。研究人员通过基因表达分析发现，氯离子通道辅助蛋白4（CLCA4）在CD133⁺CD44⁺结直肠CSCs和化疗耐药细胞中显著低表达。进一步的机制研究表明，CLCA4作为重要的肿瘤抑制因子，可能通过调控肿瘤干细胞特性影响免疫微环境，这为联合免疫治疗提供了理论依据。

本研究主要采用以下关键技术方法：首先利用5-氟尿嘧啶和顺铂诱导构建化疗耐药细胞模型；通过肿瘤球形成实验评估干细胞自我更新能力；采用蛋白质免疫共沉淀和GST pull-down技术验证CLCA4与波形蛋白的直接相互作用；建立小鼠移植瘤模型和肝转移模型进行体内验证；并通过临床样本队列（100例CRC组织）进行免疫组化相关性分析。

CLCA4表达在结直肠CSCs和耐药细胞中降低

研究人员发现CLCA4在肿瘤球和CD133⁺CD44⁺细胞群体中的mRNA和蛋白水平均显著下调。在5-氟尿嘧啶和顺铂耐药细胞中，CLCA4表达明显降低，而干细胞标志物Bmi-1、ABCG2和Oct4表达上调，提示CLCA4低表达与干细胞特性获得相关。

CLCA4过表达抑制CRC细胞增殖、侵袭和运动

通过慢病毒转染构建CLCA4稳定过表达细胞系，CCK8和集落形成实验显示CLCA4过表达显著降低细胞增殖能力。Transwell和Boyden实验表明迁移侵袭能力受到抑制，同时上皮标志物E-cadherin表达上调，间质标志物波形蛋白表达下降。

CLCA4过表达降低CRC细胞干细胞样特性

qPCR和Western blot检测显示，过表达CLCA4的细胞中Oct4、ABCG2和Bmi-1等干细胞标志物表达显著降低。肿瘤球形成实验表明CLCA4过表达细胞形成的肿瘤球数量和大小均减少，证明其抑制CSCs自我更新能力。

CLCA4减少体内肿瘤起始细胞数量

通过极限稀释法小鼠成瘤实验发现，CLCA4过表达细胞接种后肿瘤形成时间延迟，生长速度减慢，肿瘤重量减轻。免疫组化显示肿瘤组织中Ki67增殖指数和干细胞标志物表达降低。

CLCA4通过下调FAK介导的信号通路抑制结直肠CSC扩增

RNA测序和Western blot分析显示CLCA4过表达抑制FAK信号通路活化。使用FAK激动剂处理后，干细胞相关蛋白表达部分恢复，肿瘤球形成能力回升，证明FAK通路在CLCA4调控干细胞特性中起关键作用。

波形蛋白在CLCA4调控结直肠CSC扩增中的关键作用

质谱分析鉴定出336个CLCA4相互作用蛋白，其中波形蛋白引起关注。Co-IP和GST pull-down实验证实两者直接结合。过表达波形蛋白可逆转CLCA4对干细胞标志物表达和肿瘤球形成的抑制作用，并激活FAK通路。

CLCA4表达与干细胞标志物呈负相关

临床样本分析显示，CRC组织中CLCA4表达低于癌旁组织，且与Bmi-1、Oct4和波形蛋白表达呈负相关。100例CRC组织免疫组化证实CLCA4低表达与干细胞标志物高表达相关。

CLCA4过表达增强抗PD-1治疗效果

动物实验表明，CLCA4过表达联合抗PD-1治疗显著抑制肿瘤生长和肝转移，延长小鼠生存期。肿瘤微环境分析显示联合治疗组CD8⁺ T细胞浸润增加，颗粒酶B和穿孔素表达升高，干细胞特性相关指标下降。机制上CLCA4通过上调趋化因子CXCL10促进T细胞浸润，并通过调节BCR、TCR、细胞因子等免疫激活通路和抑制TGF-β信号改善免疫微环境。

本研究系统阐明了CLCA4在结直肠癌中的肿瘤 suppressor功能及其机制。CLCA4通过直接与波形蛋白相互作用，抑制FAK信号通路活化，从而降低肿瘤干细胞特性。更重要的是，CLCA4过表达能够重塑肿瘤免疫微环境，增加CD8⁺ T细胞浸润，显著增强抗PD-1免疫治疗效果。这些发现不仅为结直肠癌干细胞生物学提供了新的见解，更重要的是为微卫星稳定型结直肠癌的免疫联合治疗提供了新的策略和靶点。通过调控CLCA4-vimentin-FAK信号轴，可能成为未来克服肿瘤干细胞介导的治疗抵抗和免疫逃逸的有效方法，具有重要的临床转化价值。