病毒密码子使用与宿主tRNA修饰的协同进化：从应激响应到广谱抗病毒策略新视角

本综述深入探讨了病毒密码子使用与宿主tRNA修饰组（tRNA epitranscriptome）的协同进化机制。文章以基孔肯雅病毒（CHIKV）为模型，揭示病毒通过诱导DNA损伤应答（DDR）重塑tRNA修饰（如mcm5/mcm5s2），使宿主翻译机器优先识别病毒基因组富集的次优密码子（如AGA、GAA）。这一机制广泛存在于RNA/DNA病毒中，为开发靶向tRNA修饰酶（ALKBH8/KIAA1456）的广谱抗病毒策略提供了理论依据。

　　

引言

病毒复制周期中，病毒蛋白的高效合成是确保有效复制和子代形成的关键步骤。病毒完全依赖宿主细胞的翻译机制，并进化出多种策略来利用这一系统。翻译过程包括起始、延伸和终止三个阶段。虽然病毒调控翻译起始的机制已有深入研究，但病毒如何影响和利用翻译延伸的过程仍知之甚少。信使RNA（mRNA）中的开放阅读框（ORF）包含影响蛋白质表达的关键信息。

遗传密码的简并性使得20种氨基酸由61种密码子编码。同义密码子的使用并非随机，而是存在普遍偏好和生物体特异性倾向。密码子使用偏好与宿主转移RNA（tRNA）的浓度精细匹配。最优密码子在高表达基因中占主导地位，其对应的tRNA丰度较高；而次优密码子使用频率较低，翻译效率低下，延伸速率较慢。密码子使用偏好是基因表达的重要调控层。

由于病毒依赖宿主翻译机制，预计病毒基因会面临强大的进化压力，使其密码子使用与宿主保持一致。这种一致性在感染细菌的病毒中观察到，但在感染哺乳动物的病毒中并不明显。人类细胞中高表达的mRNA通常富含以G/C结尾的密码子，而大多数RNA病毒（包括冠状病毒、登革热病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、甲型流感病毒和人类免疫缺陷病毒（HIV））的基因组富含以A/U结尾的密码子。一些DNA病毒（如痘苗病毒（VACV）和人类乳头瘤病毒1型）也观察到这种模式。即使在同一种病毒属内，不同物种的密码子偏好也存在差异。

影响病毒密码子使用偏好的主要因素包括核苷酸和双核苷酸组成的重叠偏好。例如，HIV和其他慢病毒经常出现G-to-A转换，由逆转录酶错误驱动，促进病毒RNA中A和U的普遍存在。此外，选择性压力进一步偏向在第三位使用A而非U。哺乳动物细胞质病毒中CpG双核苷酸代表性不足，可能是为了避免免疫检测。另一个有利于单链RNA病毒中A/U富集序列的因素是RNA结构的松弛，这可能促进病毒生命周期中不同阶段之间的转换。改变病毒基因组的密码子使用、密码子偏好或核苷酸偏好几乎普遍导致病毒减毒。

转移RNA表观转录组

tRNA是70至90核苷酸长的适配器分子，负责将氨基酸运送到核糖体并解码mRNA携带的遗传信息。匹配给定mRNA密码子的带电tRNA的相对丰度调节mRNA的翻译速率。真核细胞中，tRNA分子高度丰富，占总RNA含量的10%至15%。人类细胞核基因组预测有619个tRNA基因，可能产生约400种独特的tRNA，但并非所有都在每个细胞中表达。它们的表达在不同细胞类型和发育阶段之间有所不同。

由于两个主要技术挑战，尚未确定所有组织和细胞类型中tRNA库的完整特征。首先，不同tRNA基因之间相对简单且通常共享的启动子阻碍了其转录调控的特征化。其次，tRNA的高度结构构象和广泛的转录后修饰可能阻碍逆转录并复杂化后续准确测序。然而，新的测序方法（如错误掺入tRNA测序（mim-tRNAseq）和纳米孔测序（Nano-tRNAseq））正在开始提供与不同细胞类型和细胞状态相关的tRNA组的更全面理解。

tRNA折叠成三叶草二级结构，包括三个茎环：D环、反密码子环和T环。这三个环弯曲形成L形tRNA构象。在3′端加载相应氨基酸后，tRNA通过将其反密码子（位于34、35和36位）与mRNA中互补密码子的3、2和1位配对，将这些氨基酸运送到核糖体。tRNA根据其反密码子和携带的氨基酸分为同工受体和同解码器。同工受体是携带相同氨基酸但识别不同密码子（同义密码子）的tRNA。例如，不同的同工受体tRNA识别指定精氨酸（Arg）的六个同义密码子。值得注意的是，并非所有这些密码子都有具有完全互补反密码子的特定同工受体tRNA。CGC密码子由通常与CGU密码子配对的tRNA解码。这种解码混杂性由tRNA反密码子区域的修饰促进。同解码器是具有相同反密码子但在反密码子区域外核苷酸序列不同的tRNA。这种序列变异可能影响tRNA稳定性以及与核糖体和其他分子的相互作用。人类基因组包含49个同工受体家族，这些家族中有270多个同解码器基因。tRNA同工受体和同解码器的表达是组织特异性的，并可能响应生理变化而变化。这种动态调节允许细胞根据其独特功能需求和环境条件微调蛋白质合成。

tRNA水平和功能进一步受到广泛化学修饰的调节。这些修饰由特定酶在tRNA分子内的保守位点转录后添加。其中一些修饰也可以酶促去除。总共约200种化学修饰已在RNA分子中鉴定。其中大约一半存在于tRNA中，使tRNA成为细胞中修饰最丰富的RNA类别。修饰范围从功能基团的简单添加或取代到需要多种酶的复杂结构。平均每个tRNA分子包含13种修饰，代表大约每五个残基一个修饰。这种化学修饰的广泛多样性和丰富性强调了它们在tRNA功能中的重要作用。然而，许多修饰的具体作用仍不清楚，特别是在人类和哺乳动物中，其结构和功能研究落后于细菌和酵母。此外，只有约48%的候选tRNA修饰酶在哺乳动物中经过实验验证。此外，缺乏有效的方法来精确定位和鉴定特定tRNA中的这些修饰。虽然通过液相色谱-串联质谱法对总tRNA组分进行核苷酸分析高度敏感，但它们仅提供修饰的全局水平，而没有其特定位置的信息。纳米孔测序作为一种有前途的方法出现，提供实时测序和修饰作图。然而，用这种技术准确区分所有修饰仍然存在挑战。

尽管存在这些限制，目前公认的是，位于反密码子环外的修饰主要影响tRNA折叠和稳定性，而反密码子环内的修饰对于调节和确保翻译延伸过程（包括解码、氨酰化和易位）的准确性至关重要。反密码子环表现出最高的tRNA修饰多样性。它有两个修饰热点，位于37和34位。37位的修饰增强翻译保真度并防止ORF移位，而34位的修饰影响tRNA解码能力。在密码子-反密码子相互作用期间，密码子的第一和第二核苷酸分别根据Watson-Crick碱基配对规则与反密码子的第三和第二位置（35和36位）配对。然而，密码子的第三核苷酸与反密码子的第一位置（34位）的配对并不总是遵循Watson-Crick碱基配对。这允许各种非标准相互作用，称为摆动配对。摆动配对允许编码氨基酸的61种密码子由有限数量的tRNA解码。tRNA 34位的修饰影响摆动碱基配对的灵活性，微调密码子-反密码子相互作用。这些修饰通过稳定非标准碱基配对实现同义密码子的差异识别。例如，反密码子环34位的尿苷（U34）可以与密码子第三位的腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）配对。氨基酸赖氨酸由同义密码子AAA和AAG编码。当tRNA-Arg-UCU中的U34未修饰时，反密码子可以识别两个密码子；然而，当用mcm⁵（5-甲氧基羰基甲基）或mcm⁵s²（5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷）修饰时，AAA的解码更受青睐。U34修饰在不同物种中的广泛存在强调了其进化保守性，并突出了其在翻译调节中的关键作用。除了配对限制功能外，34位的一些tRNA修饰可以扩展tRNA识别到其他同义密码子。例如，34位的A仅与U配对；然而，当修饰为肌苷时，它可以与U、C和A配对，从而扩展tRNA的解码能力。

tRNA的修饰根据环境变化和细胞应激条件动态调整。这使得细胞能够适应变化的代谢需求。一个从酵母到人类保守的典型例子与DDR有关。在酿酒酵母中的一项开创性研究表明，烷化剂增加了对tRNA修饰酶Trm9的依赖性。Trm9及其人类同源物ALKBH8和KIAA1456/TRM9L/TRM9LB（以下简称KIAA1456）是关键的tRNA修饰酶，用于在tRNA摆动位置（U34）添加mcm⁵/mcm⁵s²修饰。这些修饰有利于AGA（Arg）、GAA（Glu）、AAA（Lys）和CAA（Gln）等A结尾密码子的解码，而不是否则最优的G结尾密码子。这些密码子在细胞周期和DDR蛋白中高度富集，这些蛋白对于在DNA损伤应激下生存至关重要。tRNA表观转录组与其他应激反应之间可比较的协调相互作用现已被描述。例如，酵母中的氧化应激增加了Trm4的表达。相应的m⁵C tRNA修饰导致从氧化应激反应基因富集UUG密码子的mRNA选择性翻译，这些基因对细胞生存至关重要。热应激也有利于UUG的翻译。总之，应激反应期间tRNA表观转录组的重编程使得能够选择性翻译必需的应激反应蛋白。这些蛋白富含通常次优但在应激条件下变得最优的密码子。因此，密码子最优性不是调节翻译效率的普遍特征，而是取决于细胞的环境和特定状态。

病毒感染中的转移RNA表观转录组

我们实验室最近的工作表明，某些次优密码子为病毒蛋白生产提供了优势，表明存在强大的选择压力使其富集。使用核糖体足迹分析，我们分析了CHIKV诱导的宿主在感染细胞的内质网（ER）翻译区室中的翻译变化。CHIKV感染在ER（CHIKV RNA非常活跃翻译的区室）引起了翻译景观的深刻改变，但在细胞质中没有。这些改变是由CHIKV诱导的密码子最优性重编程引起的，该重编程有利于CHIKV RNA和富含次优密码子的宿主mRNA的翻译，而不是具有否则最优密码子使用的宿主mRNA。基因本体分析显示，翻译激活的宿主mRNA富含与DDR和细胞周期相关的基因，而翻译抑制的mRNA富含与线粒体和翻译相关的基因。当比较CHIKV RNA与翻译激活的宿主mRNA的密码子使用时，我们观察到两者都高度富集次优的A结尾密码子GAA（Glu）、AAA（Lys）、CAA（Gln）和AGA（Arg）。这表明CHIKV感染在宿主细胞中触发DNA损伤应激反应，导致密码子最优性重编程。这种重编程有利于翻译响应DNA损伤应激所需的宿主mRNA和CHIKV RNA，两者都富含相同的四个A结尾次优密码子。

如上所述，在人类中，这四个A结尾密码子的解码与同源tRNA摆动U34位的mcm⁵/mcm⁵s²修饰有关，据报道由ALKBH8驱动。然而，我们对CHIKV的研究表明，其旁系同源物KIAA1456也有助于这些修饰，因为CHIKV感染上调了KIAA1456表达并增加了mcm⁵ tRNA修饰水平。一致地，敲低或过表达KIAA1456分别抑制或增强了CHIKV RNA和蛋白水平。这些发现共同确定了病毒密码子使用对感染条件下宿主翻译环境的意外适应。与这些结果一致，抑制DDR途径 drastically reduces CHIKV病毒生产。重要的是，这种病毒-tRNA表观转录组相互作用并非独有。DENV RNA基因组富含相同的四个A结尾密码子，并且DENV感染诱导KIAA1456表达和mcm⁵修饰。

鉴于这些结果，问题变成了密码子使用适应应激反应条件在不同病毒属中有多广泛。关注图1中的相同病毒例子，密码子GAA（Glu）、AAA（Lys）、CAA（Gln）和AGA（Arg）在不同Baltimore类的病毒基因组中富集，包括人类+RNA病毒、负链RNA病毒和DNA病毒，表明适应DDR诱导的密码子使用改变的趋同进化。

DDR包括一组检测和修复DNA损伤的信号通路。人类DDR的主要组成部分包括转导激酶共济失调毛细血管扩张突变（ATM）、Rad3相关（ATR）和DNA依赖性蛋白激酶催化亚基。被DNA损伤传感器激活后，这些激酶磷酸化下游效应器，如检查点激酶1和检查点激酶2。这些效应器然后协调修复过程，包括细胞周期 arrest、DNA修复激活或如果损伤不可修复则凋亡。DNA损伤源于内源性因素（如细胞代谢过程中产生的活性氧）和外源性因素（如病毒感染）。当前数据表明DDR与病毒感染的相互作用跨越病毒属，包括DNA和RNA病毒。然而，这种相互作用是有益还是有害于病毒扩展并不统一清楚。一方面，细胞周期 arrest可以为病毒基因组扩增创造有利环境，至少对某些病毒如此。另一方面，DDR的激活也可能导致先天免疫反应和凋亡的激活，可能对病毒复制构成挑战。尽管如此，众所周知，病毒进化出复杂的策略来操纵DDR以获取优势，使它们能够减轻有害影响并提高复制效率。例如，HSV-1招募DDR组件到病毒复制位点以进行高效DNA复制，从而抑制下游ATR信号。VACV病毒激酶F10激活DNA损伤检查点蛋白，而病毒B1激酶和/或B12假激酶介导效应器p53和p21的降解，从而调节宿主细胞周期进程。HCV核心蛋白直接与MRN复合物的一个组件相互作用，抑制其组装。由于该复合物是ATM激活所必需的，因此阻止了ATM下游事件。然而，抑制DDR途径 suppresses HCV复制，表明HCV感染需要其某些组件。事实上，DDR抑制剂损害其他RNA病毒（如严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）、CHIKV或埃博拉病毒）的复制。总之，现在 evident that the involvement and regulation of the DDR are pivotal to the life cycles of a wide range of diverse viruses. 我们在CHIKV的发现为理解DDR-病毒相互作用增加了新维度，并强调需要进一步研究这种复杂关系。

图1中列出的所有病毒都被报道引起DNA损伤；然而，并非所有都富集其解码在DNA损伤条件下受青睐的四个A结尾密码子。为什么是这样？DNA损伤诱导酵母中Trm9和人类中ALKBH8/KIAA1456表达的机制未知。可能一些病毒抑制导致这些tRNA修饰酶诱导的途径。没有它们的诱导，就没有进化压力来 favor the incorporation of stress-adapted codons in the viral genomes. 这似乎是至少两种病毒的情况。HCV感染 induces DDR；然而，它不上调ALKBH8或KIAA1456表达，也不促进tRNA的mcm⁵修饰。在HSV-1感染中观察到类似模式。

除了DNA损伤驱动的mcm⁵ tRNA修饰，其他tRNA修饰可能正在塑造病毒的密码子使用。例如，氧化应激增加了tRNA Leu-CAA 34位的m⁵C修饰，导致从氧化应激反应基因富集UUG密码子的mRNA选择性翻译，这些基因对细胞生存至关重要。热应激也有利于UUG的翻译。值得注意的是，不同RNA和DNA病毒的基因组富含UUG密码子，表明病毒密码子使用对感染条件下宿主翻译环境的潜在额外适应。除了这种病毒对宿主翻译环境的适应，可以设想病毒感染对tRNA修饰的直接影响以 favor virus protein expression. 有趣的是，冠状病毒的基因组高度富集特定的U结尾密码子，其解码将通过将相应tRNA 34位的腺嘌呤修饰为肌苷而处于不利地位。这是因为肌苷修饰将tRNA识别扩展到其他以C和A结尾的同义密码子，这些密码子在病毒基因组中并不富集。因此，病毒诱导的ADAT2/ADAT3（执行肌苷修饰的二聚体）降解将有利于病毒蛋白表达。另一方面，增加这种tRNA修饰酶的表达将是一种有效的细胞抗病毒反应。

结论与未来方向

许多病毒具有次优密码子使用的长期观点显得过于简单化。如现在对CHIKV所示，病毒感染触发tRNA修饰，将先前描述为次优的密码子转变为病毒mRNA翻译的最优密码子。这不仅强调密码子最优性是细胞状态依赖的特征，而且表明是感染细胞状态可以塑造病毒密码子使用。事实上，病毒感染引起超越DNA损伤的各种应激，如氧化应激或热应激。所有这些都与由于tRNA修饰导致的密码子重编程有关。不幸的是，虽然tRNA表观转录组的研究正在快速推进，但其复杂性带来了重大挑战。我们仍然远未完全理解tRNA修饰对解码的影响，并且缺乏关于tRNA修饰酶及其响应不同应激的动态改变的全面知识，特别是在人类中。此外，考虑到tRNA景观超越tRNA修饰的复杂性，可以预测tRNA水平的变化也将在病毒翻译控制中发挥作用。事实上，它们已被显示在某些应激条件下和在DENV感染中发生改变。

其翻译在诱导DDR后的细胞中受青睐的A结尾密码子GAA（Glu）、AAA（Lys）、CAA（Gln）和AGA（Arg）在广泛范围的病毒基因组中富集。这表明了一种广泛保守的病毒策略来增强病毒蛋白表达，可以被利用来开发广谱抗病毒药物。为此，tRNA修饰酶是有希望的目标。如果此类化合物达到临床批准，它们的应用可以基于密码子使用检查，甚至对于生物学未知的新进化病毒。有趣的是，与KIAA1456/ALKBH8相同途径的tRNA修饰酶的过表达在人类癌症中观察到，并且它们的药物靶向正在研究中。

总之，病毒与感染宿主细胞的tRNA表观转录组之间的相互作用揭示了病毒-宿主相互作用的新复杂性水平。然而，密码子重编程重叠领域的重大进展仍有待到来。病毒的快速进化潜力可能被细胞生物学家利用，他们希望分配tRNA修饰酶在密码子重编程方面的功能。反过来，这些知识将对病毒学家有很大帮助。通过密码子使用检查，他们可能能够预测感染病毒可能引起的代谢变化和细胞应激。一个激动人心的时代就在前方。