流感病毒转录复制转换的分子计时器：NS2蛋白介导的精细调控机制

本综述系统阐述了流感病毒从转录向复制转换的分子机制，重点揭示了非结构蛋白NS2作为分子计时器的核心作用。文章通过结构生物学（如cryo-EM）和功能研究，详细解析了NS2通过其独特的域交换二聚体形式与病毒聚合酶（FluPol）对称二聚体结合，形成桶状六聚体复合物，进而竞争性抑制Pol II Ser5P-CTD结合并稳定FluPol的复制酶构象。同时，NS2的C端疏水性残基（如I121）通过促进聚合酶二聚化特异性增强vRNA向cRNA的合成效率。病毒利用NS基因亚优化剪接位点实现NS1/NS2的时序性表达，通过其化学计量比变化动态调控转录复制平衡，为抗病毒策略提供了新靶点。

　　

1. 引言

流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），其基因组由8个单股负链RNA节段构成，每个节段与病毒RNA依赖的RNA聚合酶（FluPol）及核蛋白（NP）组装成病毒核糖核蛋白复合体（vRNP）。在感染细胞核内，FluPol催化病毒基因组的转录（合成mRNA）和复制（合成cRNA和vRNA）。这两种过程的动态平衡在病毒生命周期中受到严格调控，感染后期从转录向复制的转换对于子代病毒的高效产生至关重要。

2. 流感病毒RNA转录与复制的结构基础

FluPol是由PB2、PB1和PA亚基组成的异源三聚体复合物。PB1包含核心催化中心，PB2的帽结合结构域（CBD）和PA的核酸内切酶结构域（PA-N）对转录过程中的“帽状结构劫持”（cap-snatching）至关重要。近年来，冷冻电镜（cryo-EM）结构研究揭示了FluPol在不同功能状态下的构象变化。

在转录状态下，FluPol呈现U形结构，其两个突出臂分别由PA-N和PB2-CBD构成。该构象允许其与宿主RNA聚合酶II的Ser5磷酸化C端结构域（Pol II Ser5P-CTD）结合，从而劫持宿主mRNA的5′帽结构作为转录引物。复制则是引物非依赖性的，包含两个步骤：以vRNA为模板合成互补RNA（cRNA），再以cRNA为模板合成新的vRNA。复制过程涉及FluPol对称二聚体（两个FluPol均处于复制酶构象）或不对称二聚体（一个复制酶构象FluPol-R与一个封装酶构象FluPol-E配对）的形成。宿主蛋白ANP32A通过其N端LRR结构域桥接两个FluPol，对稳定复制平台至关重要。

3. 流感病毒RNA与蛋白合成的动力学

病毒感染过程中，三种病毒RNA（mRNA、cRNA、vRNA）的合成呈现显著不同的动力学特征。感染早期，转录占主导，mRNA迅速积累以合成病毒蛋白；感染后期，转录活性急剧下降，复制占据主导，vRNA大量合成用于子代病毒包装。cRNA作为复制中间体，其水平在整个感染过程中始终较低。病毒蛋白的合成也呈现时序性，PB2、PB1、PA、NP和NS1早期表达，而HA、NA、M1、M2和NS2则相对晚表达。NS节段利用一个弱的5′剪接位点，使得NS2 mRNA仅占NS总mRNA的10%–15%，导致NS2蛋白的延迟累积。

4. 流感病毒RNA转录与复制的调控

4.1. 宿主因子的调控作用

宿主因子Pol II Ser5P-CTD和ANP32分别是转录和复制的关键信号。FluPol与Pol II CTD的相互作用是启动转录的前提，而感染后期Pol II大亚基的降解可能与病毒mRNA合成的减少有关。ANP32家族蛋白通过与FluPol的PA-C结构域结合，稳定其封装酶构象，并招募NP，共同促进RNP的组装和复制。

4.2. 病毒因子的调控作用

除vRNP组分（FluPol、NP）外，其他病毒蛋白如NS1、NS2（NEP）和M1也被认为参与调控。NP通过改变启动子结构和直接与PB1、PB2相互作用，促进复制并抑制转录。大量研究表明，NS2的表达能显著降低病毒mRNA的积累，同时增加cRNA和vRNA的积累。其C端结构域（CTD）被证明对产生小病毒RNA（svRNA）和增强聚合酶活性至关重要。

5. NS1与NS2化学计量比变化调控病毒RNA合成动力学**

NS1和NS2由NS节段的未剪接和剪接转录本分别翻译而来。通过模拟感染过程中NS1和NS2的表达时序与水平变化，研究发现其化学计量比的改变能够重演病毒感染中三种病毒RNA的合成动力学。功能上，NS1通过其R³⁸和K⁴¹位点介导转录上调，而NS2的N端1–20氨基酸负责转录抑制，其最末端的I121氨基酸则对复制促进功能至关重要。NS2的双重功能（抑制转录、促进复制）是解耦的，并且均具有浓度依赖性。

6. NS2作为转录-复制转换的分子开关

6.1. NS2抑制vRNA转录

全长NS2蛋白首次在其与FluPol的复合物结构中被解析。它形成一种域交换二聚体，三个这样的二聚体将三个FluPol对称二聚体组织成一个高度有序的桶状六聚体。在该复合物中，NS2-NTD的R¹⁵和K¹⁸与PB1-N和PA-C形成氢键，对其转录抑制功能至关重要。结构分析表明，NS2的结合位点与Pol II CTD在FluPol上的结合位点重叠，其结合会产生空间位阻，竞争性抑制FluPol与Pol II CTD的相互作用。同时，NS2的结合使FluPol稳定在复制酶构象，阻碍其向转录酶构象转变，从而从机制上抑制了转录。

6.2. NS2促进vRNA复制

NS2促进复制的功能与其C端疏水性残基（尤其是I121）密切相关。该功能与转录抑制无关，且能促进FluPol的二聚化。进一步研究发现，NS2特异性增强病毒复制第一步（vRNA→cRNA）的效率，这与3′-vRNA启动子的特性有关。NS2优先与vRNA结合的FluPol（vRNP-resident FluPol）结合，表明其通过靶向vRNA相关的FluPol来促进复制。

7. 未来研究展望

NS2蛋白 historically 被认为其主要功能是介导vRNP的核输出。其新发现的在转录-复制转换中的核心调控功能如何与其核输出功能整合，是未来研究的重要方向。此外，需要解析NS2与FluPol在促进复制状态下的复合物结构，以完全阐明其分子机制。对NS2和ANP32在复制中的结构和功能角色进行并行的比较研究，将有助于全面理解这一复杂过程的调控网络。

8. 总结

本综述提出了一个关于流感病毒转录-复制转换调控机制的当前假说：病毒利用NS节段的亚优化剪接位点作为分子计时器，通过控制NS1（早期表达，促转录）和NS2（晚期累积，抑转录、促复制）的化学计量比，动态精细地调控其RNA合成。在感染后期，累积的NS2通过其域交换二聚体形式结合vRNP中的FluPol，一方面竞争性抑制其与Pol II CTD的结合并锁定其复制酶构象以抑制转录；另一方面通过其C端介导的机制促进FluPol二聚化和vRNA向cRNA的合成。与此同时，宿主ANP32稳定复制平台，降解的Pol II也贡献于转录抑制。这些过程共同确保了感染后期从病毒基因转录向基因组复制的高效转换，为子代病毒的产生提供了物质基础。该机制为开发靶向病毒复制周期关键步骤的新型抗病毒策略提供了深刻的理论见解和潜在的分子靶点。