从结构视角揭示甲病毒生命周期：病毒复制与组装的分子机制及其抗病毒策略意义

本综述系统阐述了甲病毒（Alphavirus）生命周期的结构基础，聚焦病毒进入、复制复合体（RC）组装、RNA合成及病毒颗粒出芽等关键过程。通过整合冷冻电镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）等先进技术，揭示了病毒与宿主受体（如MXRA8、LDLRAD3、VLDLR）的互作机制、非结构蛋白（nsP1–4）的多功能协同及其在形成膜结合复制器室（spherule）中的作用，为开发广谱抗病毒药物和疫苗载体提供了关键结构生物学依据。

　　

THE ALPHAVIRUS LIFE CYCLE

甲病毒属于披膜病毒科（Togaviridae），是由蚊子传播的包膜病毒，具有正义单链RNA（(+)RNA）基因组。它们既能感染脊椎动物宿主（包括人类和动物），也能感染无脊椎动物载体，常引起人类疾病，范围从轻度急性发热性疾病到脑炎不等。甲病毒可分为旧世界和新世界病毒，不仅反映地理分布，还反映疾病表现。旧世界甲病毒主要分布在非洲和亚洲，引起人类关节炎性疾病，代表性成员包括基孔肯雅病毒（CHIKV）、奥尼翁尼翁病毒（ONNV）、辛德毕斯病毒（SINV）、罗斯河病毒（RRV）和塞姆利基森林病毒（SFV）。新世界甲病毒包括委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、西方马脑炎病毒（WEEV）和东方马脑炎病毒（EEEV），主要在美国流行，多引起神经系统疾病。

甲病毒病毒粒子直径约70纳米，具有球形、均匀的包膜结构。其基因组为约11–12 kb的单链正义RNA，包含两个开放阅读框（ORF）。第一个ORF编码四种非结构蛋白（nsP1–4），对病毒复制和RNA合成至关重要；第二个ORF编码结构蛋白，包括衣壳蛋白（Cp）和包膜糖蛋白（E1–3）。Cp包含一个高度带正电荷的N端结构域（NTD），与病毒RNA相互作用，以及一个C端的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域，后者从剩余的多蛋白中切割Cp，并指导剩余结构蛋白在内质网（ER）-高尔基体网络中的翻译。E1糖蛋白对膜融合至关重要，而E2主要参与受体结合。E2-E1异源二聚体三聚化形成一个 spike，80个spikes组装成一个二十面体晶格，包裹内部的核衣壳（NC）。两个同心的二十面体晶格通过脂质双层分离，并通过spike-Cp相互作用和协调的共组装良好对齐。

甲病毒在宿主细胞的细胞质中复制，其生命周期大致可分为几个关键阶段。阶段1是附着和进入：病毒与易感宿主细胞表面的特定受体结合，可能通过网格蛋白介导的内吞作用促进进入。阶段2是膜融合和脱壳：在内吞体内，病毒和内吞体膜的融合导致病毒NC释放到细胞质中，并迅速脱壳释放病毒基因组RNA（gRNA）。阶段3是nsPs的翻译：一旦进入宿主细胞，病毒gRNA被翻译成多蛋白。ORF1编码nsP1–4，这些蛋白在时间调节的方式下处理，与病毒RNA复制过程耦合。阶段4是病毒复制复合体（RC）的形成：在处理过程中，nsP1–4和病毒RNA组装成病毒RC，在宿主细胞膜上形成一个称为spherule的专门病毒细胞器。阶段5是病毒RNA复制和转录，发生在spherules内部。病毒gRNA作为合成互补抗原组负义RNA（(?)RNA）的模板，后者又作为合成全长后代gRNA和亚基因组RNA（sgRNA）的模板。这两种RNA都包含5′ cap-0结构和3′ poly(A)尾，使它们能够直接作为信使RNA（mRNA）翻译其他病毒蛋白。阶段6是结构蛋白的表达和处理：结构蛋白（C、E3、E2、6K/TF和E1）在ER膜上表达和蛋白水解处理。包膜糖蛋白通过细胞内膜运输系统修饰并转运到质膜（PM）。最后，阶段7是组装和出芽：新合成的gRNA与Cp形成NC。病毒NC和成熟的E糖蛋白在PM处组装形成新的病毒颗粒。病毒从宿主细胞表面出芽，从宿主细胞的PM获得包膜。甲病毒的整个复制周期在几小时内完成，导致感染宿主体内快速产生大量病毒颗粒。

RECEPTOR-MEDIATED VIRUS ENTRY

病毒生命周期的第一阶段是病毒与特定受体结合进入宿主细胞。这些进入受体已通过生化、功能和遗传技术被鉴定出来。目前已鉴定出八种受体，其中基质重塑相关蛋白8（MXRA8）、低密度脂蛋白受体A结构域包含3（LDLRAD3）、极低密度脂蛋白受体（VLDLR）和载脂蛋白E受体2（ApoER2）的结构已得到解析。MXRA8是一种在上皮细胞、髓系细胞和间充质细胞上表达的粘附分子，被鉴定为关节病性甲病毒（如CHIKV、RRV、马亚罗病毒和ONNV）的进入受体。敲除MXRA8可减少细胞中的CHIKV感染，给小鼠注射Mxra8-Fc蛋白或抗Mxra8阻断抗体可减少CHIKV和ONNV感染及相关足部肿胀。CHIKV病毒样颗粒与小鼠MXRA8复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构证实，MXRA8通过楔入一个三聚spike中两个相邻CHIKV E2-E1异源二聚体之间的裂隙并结合邻近的spike来结合。牛MXRA8中发现的15个氨基酸插入通过空间阻碍Mxra8与CHIKV病毒粒子的结合来赋予对甲病毒感染和发病机制的抵抗，因为该插入与异源三聚spike上的CHIKV E2蛋白A结构域中的残基发生物理碰撞，从而抑制感染。最近的研究表明，禽类MXRA8是WEEV复合甲病毒的进入受体，其结合方向与哺乳动物MXRA8与CHIKV的结合相比是翻转的，只有禽类MXRA8的结构域1与WEEV E1结合。最近，原钙粘蛋白10被鉴定为WEEV的另一种细胞受体，介导摄取和附着，并显示与另一种受体VLDLR共享WEEV E1上的结合表面。

LDLRAD3是清道夫受体超家族中一个高度保守但特征较差的成员，被鉴定为VEEV的受体。用抗LDLRAD3多克隆抗体处理细胞和在LDLRAD3敲除细胞中，VEEV感染被消除。同样，与野生型相比，LDLRAD3基因缺失的小鼠在多次VEEV感染后存活率为100%。冷冻电镜结构显示，LDLRAD3的结构域1是一个低密度脂蛋白受体A型模块，通过楔入一个三聚spike中两个相邻E2-E1异源二聚体之间的裂隙与VEEV结合。这种结合涉及E2的A和B结构域以及E1的融合环，类似于MXRA8与CHIKV的相互作用。

VLDLR和ApoER2是两种密切相关的清道夫家族受体。它们通过CRISPR/Cas9筛选在293T细胞中被鉴定出来。几种不同的甲病毒，包括SFV、EEEV和SINV，被观察到通过E2和E1糖蛋白与配体结合结构域（LBD）相互作用。抗VLDLR抗体和VLDLR LBD-Fc融合蛋白在细胞培养中抑制SFV感染，而给予VLDLR LBD-Fc融合蛋白保护新生小鼠免受致命SFV感染。最近，SFV与VLDLR复合物的冷冻电镜结构显示，VLDLR通过其膜远端LDLR A类（LA）重复序列与SFV的多个E1-DIII位点结合；特别是LA3被观察到与E1-DIII具有最佳结合亲和力。进一步的结构研究表明，LA重复序列协同工作，因为需要两个或更多才能介导有效的细胞附着病毒。相比之下，Cao等人揭示了VLDLR与EEEV的结合模式与SFV不同，LA重复序列结合EEEV上相邻E2-E1原体形成的裂隙。SFV相互作用集中在E1上的两个碱性残基；然而，EEEV与VLDLR的相互作用集中在E2上的两个碱性残基。

在鉴定各种甲病毒的进入受体方面取得了重大进展，增强了我们对病毒发病机制、趋向性和进化的理解。这些受体的详细结构表征为开发靶向治疗策略奠定了坚实基础。特定受体促进病毒进入宿主细胞，塑造了病毒感染不同细胞类型和器官的能力。这些发现提供了关于甲病毒如何适应不同宿主和组织、逃避免疫防御并建立感染的关键见解。例如，阻断甲病毒与其进入受体之间的相互作用可以在最早阶段抑制病毒感染， potentially 防止病毒复制和减轻疾病严重程度。此外，受体特异性信息可以指导设计疫苗，引发针对阻断受体介导的病毒进入的免疫反应。

THE ALPHAVIRUS GENOME

甲病毒的约11–12 kb正义RNA基因组编码两个ORF，并具有5′ m⁷G帽结构，称为cap-0。功能元件包括5′非翻译区（UTR）；ORF1，编码nsP1–4并部分延伸到26S亚基因组启动子区域；ORF2，编码结构蛋白；以及最后的3′ UTR和poly(A)尾。病毒基因组必须在编码大量信息的同时克服空间限制。因此，甲病毒RNA除了蛋白质编码序列外，还包含重要的调控顺序和结构元件。这些功能性RNA元件既存在于基因组的非编码部分，如5′和3′ UTR，也存在于编码区域。例如，nsP1中的51核苷酸保守序列元件（CSE）和结构多蛋白包含包装信号和移码信号。

5′ UTR的长度因甲病毒而异，从SFV的最长（85核苷酸）到鲑鱼甲病毒的最短（27核苷酸）。5′ UTR的结构和序列都调节甲病毒基因组的翻译。尽管长度不同，但5′ UTR末端的AU二核苷酸高度保守，并且是病毒复制所必需的。虽然5′ UTR序列和结构在RNA合成中的确切作用尚未完全了解，但已提出宿主和病毒复制所需的因子以序列和结构依赖的方式与5′ UTR相互作用。例如，在SINV中，5′ UTR二级结构的改变具有有害影响，包括抑制病毒生长和积累适应性突变。在新世界甲病毒如VEEV中也报道了类似发现，其中5′ CSE的缺失也导致适应性突变。5′ UTR也与发病机制有关。例如，VEEV TC-83毒株gRNA位置3的单核苷酸替换影响对干扰素诱导的四肽重复蛋白1的敏感性。具体来说，A3G突变赋予对I型干扰素的抗性。

紧随5′ UTR的是ORF1，它直接从病毒RNA基因组翻译。ORF1编码一个四成员多蛋白（nsP1–4），构成负责病毒RNA复制和转录的RC。sgRNA的合成由26S亚基因组启动子调节，该启动子与核苷酸位置重叠，跨越ORF1的3′端（nsP4的C端）和ORF2的开始。ORF2从sgRNA转录，编码结构蛋白（C、E3、E2、TF/6K和E1）， required for the maturation and assembly of virions. Finally, the 3′ UTRs of alphaviruses range in length from 77 to 609 nucleotides. A highly conserved CSE 19 nucleotides in length, located immediately upstream of the poly(A) tail in all alphaviruses, likely serves as the priming site for (?)RNA synthesis. Mutations in this region have been shown to result in reduced plaque size and impaired viral replication in SINV. Together with the poly(A) tail, they support efficient translation and (?)RNA synthesis, with a minimum of 11 residues required to facilitate interaction with the poly(A)-binding protein. In addition to the CSE, the 3′ UTRs of many alphaviruses contain repeat sequence elements that vary in both number and length. Although their exact roles remain undefined, it has been suggested that they play a role in replication within mosquito cells, as evidenced by deletions observed in EEEV and CHIKV Asian lineage strains resulting in reduced replication in mosquito cells. The 3′ UTR is also known to mediate host cell tropism, immune responses, and viral pathogenesis through its interactions with host cellular proteins and microRNAs.

ALPHAVIRUS NONSTRUCTURAL PROTEINS

甲病毒的nsP1–4蛋白因其酶和非酶功能而得到充分表征。S-棕榈酰化的甲病毒nsP1形成一个十二聚体环结构，将RC锚定在宿主PM上，促进膜重塑和spherules的形成，这些膜结合结构对病毒RNA复制至关重要。nsP1的N7-鸟嘌呤甲基转移酶和鸟苷酰转移酶活性对病毒RNA的5′端进行酶促加帽。纯化的重组CHIKV nsP1被显示可以逆转鸟苷酰转移反应，并从各种带帽RNA底物（包括宿主mRNA）中去除m⁷GMP，这被暗示会触发视黄酸诱导基因I介导的干扰素反应。多功能nsP2呈现三个对病毒复制和增殖重要的特征。第一个是N端病毒超家族1 RNA解旋酶，具有5′-三磷酸酶（RTPase）和NTP酶活性。RTPase活性从合成RNA的5′端去除γ-磷酸，为加帽准备合适的底物。nsP2解旋酶被认为在病毒RNA复制过程中解析RNA二级结构和双链区域。第二个是C端蛋白酶活性，用于多蛋白自处理以形成spherule/RC和nsP3丝。最后是能够通过核STAT1输出和RNAPII复合物解体 via POLR2A亚基降解来抑制宿主转录。nsP3包含一个N端宏结构域（MD），一个甲病毒独特结构域，和一个高变结构域（HVD）。MD的ADP-核糖基化活性靶向宿主因子，以操纵宿主细胞活性，优先进行病毒RNA复制。本质上无序的HVD是一个繁忙的宿主因子相互作用枢纽，以影响细胞活动以利于病毒RNA复制，例如Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白（G3BPs）以防止应激颗粒的形成，Bridging Integrator 1，Fragile X综合征（FXR）家族蛋白，和four-and-a-half LIM（FHL）。nsP3的管状丝结构（PDB：8PK7）具有螺旋对称性，表明它可能存在于甲病毒RC的胞质环和邻近的胞质空间中。CHIKV nsP3 HDR肽与G3BP1 NTF2L结构域复合物的冷冻电镜结构，形成由FGDF motif和α-螺旋介导的双环寡聚体， demonstrated how CHIKV nsP3 recruits G3BP1 to suppress stress granules. As the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), alphavirus nsP4 comprises a highly dynamic alphavirus-unique NTD not observed in other (+)RNA viruses and a crystallizable C-terminal RdRp domain with a classical right-hand encircled fold (PDB: 7F0S for RRV, 7VB4 for SINV). However, the recombinant alphaviral nsP4 RdRp is partially unfolded and performs poorly in in vitro polymerase assays.

ASSEMBLY AND FUNCTION OF THE ALPHAVIRUS REPLICATION COMPLEX

甲病毒的RC，也称为spherule，是一个向外突出的、芽状的特化细胞器，主要形成于感染宿主细胞的PM或细胞内膜上。Spherule的生物发生涉及甲病毒成分（如nsPs和RNA基因组）和宿主衍生材料（包括脂膜和宿主因子）的组装。甲病毒nsP1–4最初作为多蛋白产生，经过自我切割产生四个独立的蛋白质。这些蛋白质锚定并重塑宿主细胞膜，驱动spherules的形成。Spherules拥有一个孔状颈，将其内部与细胞质连接起来， enabling the selective exchange of biomolecules required for viral replication.

最近使用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和冷冻电镜的研究提供了这些spherules的详细分子结构，揭示了nsP1如何招募其他伙伴到膜上，以及病毒基因组及其RNA复制过程如何在spherule内组织起来， protected from host immune responses. The cryo-EM structure of the RC core (PDB: 7Y38) revealed spatial coordination of biological active assembly docked at the spherule neck containing nsP1, nsP2, and nsP4 with structurally stabilized interaction interfaces, especially at the nsP4 NTD, which was initially unfolded on its own. A single subunit of nsP4 mediates three-way extensive asymmetrical interactions with the hooking loop from the inner face of the nsP1 dodecameric ring and with a copy of nsP2 N-terminal helicase. The enhanced nsP4 enzymatic activities for RNA synthesis and polyadenylation are likely regulated to occur precisely within the spherule space after structural assembly of RC. An RNA pore of sufficient size for RNA trafficking was also observed in the RC core structure.

尽管对病毒复制的分子理解有限，但最近的突破使得讨论整合当前知识和需要未来验证的假设见解的各种病毒复制模型变得重要。通常，病毒复制机器的生物发生被认为始于spherules在未成熟RC组装过程中的形成。这个过程涉及一个nsP123多蛋白，包含一个推定的环状结构，与PM相关联，并由nsP4在其中心孔堵塞。随后可能是gRNA通过未成熟RC的RNA孔导入spherule空间，导致spherule体积扩张。过渡到中间RC阶段，从gRNA的3′ UTR区域 de novo 启动(?)RNA生产是由部分处理的未成熟RC（nsP1 + nsP23多蛋白 + nsP4）驱动的，伴随着NTP的摄取，随后在完全膨胀的spherule内形成双链RNA中间体。完全处理的nsP1–4最终组装成成熟RC，开始从(?)RNA模板合成(+)RNA。成熟RC随后转换产生sgRNA用于结构蛋白表达。为了可持续的病毒复制过程，spherule内活跃复制的RC的连续RNA合成可能与通过RNA孔的RNA运输耦合。这种耦合解释了新合成的RNA如何被输出用于nsP2 NTP酶活性进行5′端鸟嘌呤去磷酸化，从而实现随后的nsP1加帽。它还说明了spherule如何在高曲率条件下维持在一致的体积范围内。

加帽的RNA可能通过胞质环进行，胞质环被认为容纳nsP3和宿主因子，进入细胞质进行进一步的病毒蛋白表达。这些病毒蛋白可能调节宿主细胞活动。复杂的甲病毒复制过程可能与病毒颗粒组装协同关联。细胞质中输出的sgRNA立即被附近游离核糖体翻译成结构蛋白，随后在细胞内膜网络上处理。这种处理导致RNA包装成NC，并合成其他结构蛋白，如E1-E2，这些对病毒颗粒组装和出芽至关重要。

未来的挑战仍然在于捕获早期和中间RC物种的短暂生物发生状态，以及(?)RNA合成的高分辨率图像。这些研究对于理解它们的结构、功能和在抗病毒开发中的潜在应用至关重要。尽管最近发现了形成胞质alpha-颗粒超微结构的管状nsP3丝，但它们的胞质作用尚未完全了解，并且在并入RC异复合物时可能结构上有所不同。此外，RC中胞质环的低分辨率结构阻碍了识别驻留蛋白（如可疑的nsP3和宿主因子）的努力，以及确定nsP3是否直接参与病毒复制过程。具体来说，nsP3如何与病毒RNA相互作用，将其引导至细胞质或alpha-颗粒以促进RNA包装，仍不清楚。总体而言，早期、中间和成熟RC多个物种的高分辨率结构阐明对于全面绘制病毒复制过程至关重要。这将阐明病毒成分（nsP1–4和RNA）、宿主因子的作用以及RNA运输的途径。

ALPHAVIRUS PARTICLE ASSEMBLY AND RELEASE

包膜病毒的组装是一个精心策划的过程，涉及弯曲细胞膜，将所有必要成分整合到病毒颗粒中以随后的细胞感染，以及最终病毒和细胞膜之间的分裂以释放完全组装的病毒粒子。在对甲病毒组装和出芽的开创性探索中，Chmielewski等人使用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）精心捕捉了CHIKV感染的人细胞中甲病毒组装/出芽中间体形成过程中细微的事件协调。预形成的类核衣壳颗粒（NLP）缺乏可观察到的对称性，比成熟病毒粒子中的NCs小。然而，它们与spikes的相互作用启动了一个转化过程。逐渐地，这些NLP获得二十面体对称性，这是它们在PM下被spike晶格包裹过程中发生的关键步骤。NLP作为粗糙支架启动T = 4曲率，而不是作为模板触发包膜spike晶格的二十面体组装。Spike晶格可能通过与其他spikes的横向自相互作用生长，并通过直接的spike:Cp接触逐步将底层最初不对称的NLP重组为扩展的二十面体病毒NCs。在没有底层NCs的情况下，spikes表现出自组装成罕见六边形晶格的能力，覆盖平板或形成薄膜管，揭示了甲病毒组装过程的显著多功能性。虽然Cp和spike独立都有自组装成大复合物的能力，但两种成分的协作努力对于形成T = 4二十面体病毒粒子至关重要。

Lazaro, Mukhopadhyay & Hagan的模拟表明，一旦spike壳大约完成三分之二，病毒组装显著减慢， due to high negative Gaussian curvature at the budding neck, which impedes subunit diffusion and delays budding. It was observed that late-stage assembly intermediates (>90% completion) with a disordered trailing pole with expanded spikes accumulate on the surface of infected cells. This suggests that icosahedral lattice imperfections arise during assembly and pinch off. 甲病毒固有的几何缺陷可能限制了在纯化甲病毒颗粒的冷冻电镜重建中施加二十面体对称性时的分辨率。最近，几种基于亚颗粒的重建协议被独立开发出来，以校正大甲病毒颗粒中的Ewald球效应，并通过将初始二十面体重建划分为更小的块来解决粒子内异质性，小到单个不对称单元。这些方法已将甲病毒结构的分辨率显著提高到近原子（～3 ?）水平。

在过去的十年中，大量抗甲病毒抗体已被分离和彻底表征，以准备这些载体传播病毒的潜在爆发。最近一篇出色的综述深入探讨了甲病毒进入的复杂机制，并探索了针对不同表位的中和抗体（NAbs）。值得注意的是，在各种甲病毒新分离的抗体中，那些交叉反应并靶向spike糖蛋白保守区域的抗体引起了特别关注。这些抗体表现出抑制病毒出芽并提供体内保护的能力，使它们成为有前景的泛甲病毒治疗剂。用特定NAbs处理的CHIKV感染细胞的细胞冷冻电子断层扫描可视化，结合功能研究， revealed that budding inhibition depends on the bivalent binding of full IgG molecules to distinct spikes on the cell surface. This disrupted the assembly of the spike icosahedral lattice, leading to the formation of flat spike patches and arresting NCs in the cytosol, thereby blocking virus budding at the cell surface.

CONCLUDING REMARKS AND OUTSTANDING QUESTIONS

甲病毒已成为研究RNA病毒生物学的突出模型，这主要归功于它们充分表征的复制周期和在实验室环境中易于操作的特点。它们利用多种受体进入宿主细胞的能力， coupled with unique mechanisms for RNA replication, assembly, and budding, makes them ideal subjects for investigating fundamental viral processes. 我们对甲病毒生物学理解的最新进展提供了对其生命周期关键阶段的关键见解，从病毒进入和受体相互作用到nsPs的功能、RNA复制和病毒组装。这些发现阐明了病毒成分和宿主细胞机制之间复杂的相互作用，揭示了甲病毒如何在宿主细胞内有效复制和组装。此外，对甲病毒诱导的免疫反应和抗体保护机制的更深入理解增强了我们对宿主-病毒相互作用的认识，并为治疗干预提供了新途径。

尽管有这些见解，但我们对甲病毒生命周期的理解仍存在显著差距，特别是在病毒进入、复制和组装方面。一些差距列在此处：1. 受体结合如何触发病毒进入宿主细胞？甲病毒进入涉及哪些特定的内吞途径，或者是否存在甲病毒感染的替代非内吞途径？2. 病毒糖蛋白中的构象变化如何触发膜融合？3. 衣壳脱壳在宿主细胞胞质溶胶中如何调节？是否有任何宿主因子参与脱壳过程？4. 病毒gRNA在衣壳脱壳后释放到胞质溶胶后，从病毒蛋白翻译到RNA复制的转换如何调节？这对于理解复制周期的启动至关重要。5. 从(?)RNA到(+)RNA和到sgRNA合成的转换如何调节？确保正确合成全长gRNA和sgRNA的机制是什么？6. 病毒gRNA在组装过程中如何选择性包装到NCs中？理解gRNA包装的机制对于理解病毒粒子形成至关重要。7. 许多细胞因子，如G3BPs，如何在分子水平和系统水平上促进病毒复制、病毒组装和出芽？

解决这些关键问题将增强我们对甲病毒生物学的理解，并为开发靶向治疗策略开辟新的机会。