密码子特异性核糖体停滞在支链氨基酸饥饿期间重塑翻译动力学

本研究通过整合多组学技术，系统揭示了支链氨基酸（BCAAs）饥饿条件下翻译延伸阶段的密码子特异性调控机制。研究人员发现缬氨酸饥饿会引发5'端核糖体停滞瓶颈，并首次报道了三种BCAAs联合饥饿时产生的非叠加效应。该研究阐明了tRNA氨酰化状态与密码子使用偏好的动态关联，为营养应激下的翻译重编程机制提供了全新见解，对代谢性疾病和肿瘤治疗策略具有重要启示意义。

　　

在细胞生命活动中，蛋白质合成是最耗能的过程之一，其精确调控对维持细胞稳态至关重要。支链氨基酸（BCAAs）——亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）作为必需氨基酸，不仅参与蛋白质合成，还在代谢调控、信号传导和免疫应答中发挥关键作用。然而，当这些氨基酸供应受限时，细胞如何协调翻译机器以适应营养胁迫，特别是不同组合的BCAA缺乏对翻译延伸动力学的影响，仍是未解之谜。

传统观点认为，氨基酸饥饿主要通过抑制翻译起始来降低全局蛋白质合成。例如，mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）通路失活会减少核糖体装配，而GCN2（General Control Nonderepressible 2）激酶感知未充电tRNA后磷酸化eIF2α（eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 1），选择性调控应激基因翻译。但近年研究发现，氨基酸可用性同样显著影响翻译延伸过程，特定氨基酸短缺可能导致密码子特异性核糖体停滞，进而影响翻译效率甚至蛋白质折叠质量。尤其是在支链氨基酸饥饿场景下，由于三者代谢的相互关联性，其联合缺乏可能产生独特的协同或拮抗效应，这尚未得到系统研究。

为深入探索这一问题，洛桑联邦理工学院（EPFL）的Lina Worpenberg等研究人员在《Genome Biology》发表了最新成果。他们通过整合核糖体分析（Ribo-seq）、转录组测序（RNA-seq）、定量蛋白质组学和tRNA氨酰化测定等多组学技术，首次系统描绘了NIH3T3细胞在单一或组合BCAA饥饿条件下的翻译景观。研究不仅揭示了鲜明的密码子特异性停滞模式，还发现了一种由缬氨酸密码子5'端富集引起的延伸瓶颈现象，该现象在联合饥饿时显著改变异亮氨酸密码子的停滞行为。

研究人员主要采用了几项关键技术：首先利用核糖体分析技术（Ribo-seq）在单密码子分辨率下定量核糖体驻留时间；其次通过TMT（Tandem Mass Tag）标记的定量蛋白质组学分析6小时饥饿后的蛋白质组变化；此外采用高碘酸盐氧化结合tRNA同工受体特异性RT-qPCR技术测定tRNA氨酰化状态；并辅以多糖体谱分析和OPP（O-propargyl-puromycin）掺入实验验证全局翻译速率变化。所有实验均在NIH3T3细胞系中完成，包含三组生物学重复。

翻译延伸速率在BCAA限制下发生密码子特异性非叠加性调控

通过比较六种饥饿条件（对照组、-Leu、-Ile、-Val、双缺-Leu/-Ile和三缺-Leu/-Ile/-Val），研究人员发现缬氨酸饥饿在所有四种Val密码子（GUU、GUC、GUA、GUG）均引起显著的核糖体驻留时间（DT）增加，而异亮氨酸饥饿仅影响AUU和AUC密码子，亮氨酸饥饿仅轻微影响CUU密码子。令人惊讶的是，在三重饥饿条件下，仅Val密码子保持停滞，而Ile密码子的停滞现象完全消失。这种非叠加效应通过核糖体密度分布分析得到进一步验证。

亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸饥饿差异激活应激响应通路

虽然所有饥饿条件均激活整合应激反应（ISR）标志物（如ATF4和CHOP），但mTORC1活性抑制程度存在显著差异：双缺饥饿引起最强的mTORC1抑制（RPS6和4E-BP1磷酸化下降），而Val和三缺饥饿的影响较弱。对应地，mTORC1敏感的TOP（terminal oligopyrimidine tract）转录本翻译在双缺饥饿中下调最显著。

BCAA饥饿差异调控翻译起始与延伸

OPP掺入实验显示所有饥饿条件均降低全局蛋白质合成（降低46-65%），但多糖体谱分析揭示重要差异：Ile饥饿保持多糖体/单糖体（P/M）比率不变，表明延伸受阻占主导；而其他条件P/M比率下降约50%，提示起始抑制为主。这种分化说明不同BCAA缺乏通过 distinct 机制影响翻译流程。

BCAA饥饿重塑蛋白质组

定量蛋白质组学鉴定到7,004种蛋白质，其中Val和三缺饥饿引起最显著的蛋白质组变化（分别224和193种蛋白质下调）。值得注意的是，86.9%的下调蛋白质在Val饥饿时伴有核糖体停滞位点，且多停滞位点转录本与蛋白质下调显著相关，表明延伸缺陷直接贡献于蛋白质输出减少。

BCAA饥饿导致核糖体密度向CDS的5'端偏移

metagene分析显示所有饥饿条件均引起5'端核糖体积累，但Val和三缺饥饿表现出最强的5'极性偏移。这种偏移与5'端Val密码子富集显著相关，例如Cbx1基因的5'端多个Val密码子区域出现核糖体堆积。位置特异性分析表明，转录组范围内Val密码子确实偏向分布于5'端区域，而Ile密码子更多位于3'端。

非均匀分布的密码子产生延伸瓶颈

通过停滞位点调用分析，研究人员发现Val饥饿产生11,953个停滞位点（涉及3,197个基因），远超其他条件。重要的是，在三重饥饿中，Ile相关停滞位点消失，但含有Ile停滞位点的转录本仍普遍发生停滞（1,806个基因），只是停滞位置转移至上游Val密码子。转录本水平分析证实，Val停滞位点通常位于Ile停滞位点上游，表明5'端Val停滞形成物理瓶颈，阻止核糖体进展至下游Ile密码子。

差异tRNA氨酰化模式揭示BCAA饥饿下密码子特异性停滞的机制基础

tRNA充电测定显示，Val和三缺饥饿导致所有tRNA^Val同工受体充电水平显著降低，而三重饥饿并未减少tRNA^Ile或tRNA^Leu充电。与之对应，Ile饥饿仅降低解码AUU/AUC的tRNA^Ile_AAU充电，对解码AUA的tRNA^Ile_UAU无影响；Leu饥饿轻微影响tRNA^Leu_AAG（解码CUU）。用放线菌酮（CHX）抑制翻译后，所有tRNA充电水平恢复，证实翻译消耗直接导致氨酰化不足。抑制自噬和蛋白酶体降解途径（氨基酸回收）进一步加剧tRNA^Val耗竭，但不影响tRNA^Ile，支持瓶颈模型：早期Val停滞减少下游Ile密码子的解码需求。

本研究系统阐明了BCAA饥饿下翻译调控的多层次机制：不同BCAA缺乏通过差异调节应激通路（mTORC1和GCN2）、tRNA氨酰化状态和密码子位置效应，产生独特的翻译重编程模式。特别是发现Val密码子的5'端富集特性可在联合饥饿时创建延伸瓶颈，改变下游翻译动力学。这种位置依赖性调控不仅解释了非叠加效应，也揭示了细胞在多重营养限制下优先保全翻译能力的策略。

该研究的重大意义在于突破了传统认知中氨基酸饥饿主要影响起始的观点，率先揭示联合氨基酸缺乏产生的非叠加效应及其空间机制，为理解营养应激下的翻译调控提供了全新视角。这些发现对代谢性疾病（如肥胖、糖尿病）、肝脏疾病和肿瘤治疗具有重要启示，因为BCAA代谢异常是这些疾病的共同特征。未来针对特定tRNA同工受体或密码子使用模式的干预策略，可能为相关疾病提供新的治疗思路。