混合BAG-seq技术揭示人类肿瘤样本中基因组与转录组景观的相互作用

为解决单细胞多组学整合的技术瓶颈，研究人员开发了高通量混合BAG-seq方法，首次实现从同一细胞核同步捕获DNA与RNA。该研究在5例子宫癌样本的65,499个单核中验证了DNA克隆与表达状态的复杂关联模式，发现肿瘤克隆可投射至共享或独特的表达状态，并鉴定出基质细胞中X染色体缺失的克隆扩增现象。这项工作为理解肿瘤异质性和微环境互作提供了突破性工具。

　　

癌症研究领域长期面临一个关键挑战：如何同时获取单个细胞的基因组和转录组信息，从而真正揭示遗传变异与基因表达之间的动态关联。传统单细胞测序技术往往只能分别检测DNA或RNA，使得研究人员难以确定特定的基因突变如何直接影响细胞的转录状态。特别是在肿瘤研究中，这种局限性更为明显——我们无法准确判断某个DNA拷贝数变异是否驱动了特定的表达程序，或者某些看似"正常"的基质细胞是否实际上携带了致癌突变。

为了解决这一难题，冷泉港实验室的Siran Li团队在《Genome Biology》发表了突破性研究成果。他们开发了名为杂交BAG-seq（hybrid BAG-seq）的创新技术，首次实现了从同一个细胞核中同步捕获DNA和RNA模板的高通量测序。这项技术不仅为肿瘤生物学研究提供了强大的新工具，更带来了对癌症异质性和肿瘤微环境的新认识。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先利用微流控液滴系统将单个细胞核与丙烯酰胺凝胶球（BAG）共包裹，通过Acrydite修饰的引物同时捕获基因组DNA和核RNA；接着通过pool-and-split策略为每个分子添加细胞条形码和唯一分子标识符（UMI）；最后通过tagmentation建库进行Illumina测序。研究队列包含5例子宫癌患者（2例癌肉瘤、1例浆液性癌、1例子宫内膜样腺癌和1例平滑肌肉瘤）的新鲜冷冻组织样本，并通过同一来源材料进行了全基因组测序（WGS）验证。

实验设计

研究团队通过液氮研磨将冷冻组织样本粉碎成均匀粉末，从中提取细胞核进行单细胞DNA、RNA以及DNA-RNA混合BAG平台分析。杂交BAG平台的核心创新在于使用oligo-TG引物和oligo-T引物同时捕获DNA和RNA模板，并通过DNA聚合酶和逆转录酶将模板转录到锚定引物上。

基因组过滤器

研究人员建立了严格的序列分类标准，将模板分为"外显子"、"内含子"、"基因间区"和"未分类"四类。为控制杂交数据中的偏差，他们排除了多聚T/A富集区等基因组热点区域，这些区域有许多核RNA序列映射。最终选择仅使用"基因间区"模板进行DNA层分析，这一策略显著提高了拷贝数数据的质量。

聚类RNA和DNA层

研究采用Seurat软件包进行单细胞序列分析，不仅对RNA层进行表达聚类，还创新性地将其应用于DNA层聚类。他们使用300个基因组区间（bins）进行DNA聚类和拷贝数分析，这些经验性区间的中位大小为9.5Mbp，在基因组分辨率和平均每bin计数之间提供了良好平衡。

杂交平台与DNA-only和RNA-only平台相当

通过与DNA-only和RNA-onlyBAG平台的比较研究，证实了杂交BAG-seq数据的可靠性。在DNA层分析中，杂交数据与DNA-only协议一致地解析了六个簇：包括典型二倍体谱系的N簇、X染色体缺失的二倍体细胞Nx簇，以及四个异倍体肿瘤克隆（A、B、C和D）。平均拷贝数谱显示高度一致性，异质性SNP分析也显示相似的杂合性缺失（LoH）和等位基因失衡模式。

使用杂交数据分析肿瘤样本的基因组和转录组

对五个肿瘤的DNA和RNA层分别进行聚类分析后，研究人员通过alluvial图量化了特定DNA簇的细胞出现在给定RNA簇中的频率。每个肿瘤都展示了不同的投射模式：从肿瘤克隆投射到 distinct表达簇（如肿瘤5的[A:1; B:2]），到共享簇（如肿瘤1的[A:1,2; B:1,2]），再到混合模式（如肿瘤4的[A:1,2; B:1]）。这些模式表明肿瘤基因组与转录组之间存在着复杂的相互关系。

所有患者样本的联合聚类

整合所有患者的RNA层数据进行聚类分析，发现了23个不同的基质表达簇，其中21个包含来自多个患者的细胞核，表明多数基质细胞类型具有跨个体的一致性表达模式。相比之下，每个肿瘤簇仅出现在一个患者中，不同患者的肿瘤簇之间几乎没有共同之处。

多元轮和交叉

研究团队开发了多元轮（multinomial wheel）方法来区分混合状态，识别出1-5%的细胞核具有"交叉"特征（二倍体拷贝数谱与肿瘤表达模式组合，或拷贝数变异与基质表达模式组合）。通过碰撞过滤，这些交叉细胞核的比例显著减少，表明它们可能是未解决的双重碰撞（doublet collisions）的结果。

基质细胞中X染色体的缺失

研究发现二倍体细胞中存在X染色体丢失（Nx）的亚群，并在患者2的浆细胞群体中进行了深入分析。单倍型分析显示，Plasma-Nx细胞核都丢失了相同的X染色体，而T细胞Nx群体则显示两种单倍型，表明浆细胞群体可能有共同起源。差异表达分析显示Nx群体中XIST和TSIX表达降低，证实了DNA层观察到的X丢失是真实的基因组事件。

讨论与结论

杂交BAG-seq技术的开发标志着单细胞多组学分析的重大进步。研究表明，仅凭RNA数据无法明确区分基质表达状态与肿瘤或肿瘤前体状态，特别是在基质群体表现出非典型表达或肿瘤细胞模仿正常细胞时更为困难。将单细胞DNA和RNA从同一细胞核整合，为了解癌症生物学提供了前所未有的视角。

这项研究揭示了肿瘤基因组与转录组之间复杂的关系模式，几乎观察到了所有可能的基因组-转录组相关性。不同肿瘤克隆可以投射到不同的表达状态，这种可塑性可能在肿瘤进化过程中得以保留。研究还发现基质细胞中存在有趣的亚克隆，如浆细胞群体中的X染色体缺失事件，这些发现为了解肿瘤微环境的复杂性提供了新线索。

杂交BAG-seq平台的优势在于其灵活性和可扩展性。未来版本可以整合表观遗传特征分析，如通过转座酶将Acrydite修饰的转座子纳入以访问开放染色质区域。此外，该平台的自然延伸可作为靶向特异性捕获平台，用于富集肿瘤或种系变异，无论这些变异位于染色体还是线粒体序列上。

这项技术为空间转录组学应用提供了强大支持，通过指导选择最能代表肿瘤亚克隆、体细胞变异甚至基质突变的信息基因，使空间转录组学分析能够进行基因组谱系追踪和突变信息映射。总的来说，杂交BAG-seq不仅提供了技术突破，更为我们理解癌症进化、基质突变和肿瘤微环境提供了新的视角和方法论基础。