综述：重编程细胞身份与代谢以驱动心肌细胞增殖

本综述系统探讨了心肌再生领域的突破性进展，聚焦于通过调控心肌细胞去分化（Dedifferentiation）、增殖（Proliferation）与再分化（Redifferentiation, DPR）过程及代谢重编程（Metabolic Reprogramming）来逆转成年哺乳动物心脏再生能力丧失的难题。文章不仅揭示了Hippo-YAP、NRG1-ErbB2/4等关键信号通路和PKM2、CPT1B等代谢靶点的核心作用，还强调了猪（Swine）大动物模型在临床转化中的重要性，为心力衰竭治疗提供了多层面的创新策略。

　　

分子网络协调去分化、增殖与再分化（DPR）过程

心脏再生在成年斑马鱼和新生小鼠中涉及一个协调的去分化（Dedifferentiation）、增殖（Proliferation）和再分化（Redifferentiation, DPR）序列。在这个过程中，终末分化的心肌细胞（CMs）短暂地恢复到一种胚胎样的、可塑的状态，重新进入细胞周期，随后再分化以恢复心肌的结构和功能。越来越多的证据表明，DPR的每个阶段都由一个多方面的调控网络 orchestrate。

心肌细胞去分化的机制性见解

去分化是关键的起始事件，其中成熟的心肌细胞部分恢复到胚胎样的、可塑的状态。然而，定义这种状态的分子和细胞特征仍然不完全清楚。多种调节因子与心肌细胞去分化有关，包括信号通路、转录因子、细胞外基质成分、细胞周期调节因子和重编程混合物。这些调节因子共同驱动去分化的标志性特征：细胞周期基因的上调、肌节分解、胚胎标志物（如Nppa、Nppb、Myh7）的重新表达、代谢重塑以及结构蛋白（如连接蛋白43, CX43）的抑制。从机制上讲，许多这些调节因子汇聚到几个保守的下游通路上。例如，YAP、ERK和AKT已被证明介导了去分化以响应各种上游信号。这些级联反应通过多种机制发挥作用，包括调节染色质可及性、肌动蛋白聚合和胎儿转录程序的重新激活。在Hippo通路中，哺乳动物Ste20样激酶（MST）、大肿瘤抑制激酶（LATS）和Salvador（SALV）作为上游激酶，通过抑制YAP、转录增强关联结构域1（TEAD1）和制瘤素M（OSM）来抑制去分化。一旦从这种抑制中释放出来，YAP就会 orchestrate 一个广泛的促去分化程序，包括细胞骨架重塑、染色质松弛和有丝分裂基因的激活。这种转录可塑性与结构和信号线索相辅相成。例如，在斑马鱼中，Krüppel样因子1（Klf1）通过抑制核心心脏转录因子（如Mef2、Gata4和Nkx2.5）来促进去分化和增殖。类似地，细胞外基质蛋白Agrin和NRG1-ErbB2/4信号增强了YAP、ERK和AKT的激活以启动去分化。除了单通路调节外，还开发了多靶点重编程混合物来增强去分化。这些混合物包括CDK1、CCNB1、CDK4、CCND1（4F）、Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM），以及苯肾上腺素盐酸盐、巴瑞替尼、哈尔明、VO-OHpic三水合物和AZD3965（5SM），所有这些都促进了去分化表型，如肌节分解和去分化标志物增加。有趣的是，研究发现5SM激活去分化不依赖于Hippo-YAP和NRG1-ErbB2/4通路，这表明存在先前未被认识的机制。

单靶点与多靶点方法调节心肌细胞增殖

在过去的二十年里，在阐明驱动损伤诱导的心肌细胞增殖的机制方面取得了实质性进展。其中研究最充分的通路之一是Hippo-Yes相关蛋白（YAP）信号级联，最初因其在胚胎发育和器官大小控制中的作用而被认识。该通路的核心组成部分，包括MST、LATS和SALV，已成为心脏再生的关键调节因子。除了其直接的促有丝分裂效应外，Hippo-YAP信号整合了来自各种上游通路的信号，并与其他心脏网络交叉对话以调节再生结果。为了剖析YAP激活的再生潜力，研究采用了多组学和生化方法来探究其下游机制。他们的工作表明，过表达组成型活性YAP突变体YAP5SA，可以将成年心肌细胞重编程为一种胚胎样的、增殖状态。在此背景下，他们确定了一个对YAP有反应的亚群，称为aCM2，其特点是YAP活性增高和再生潜力增强。这些aCM2细胞与表达补体的成纤维细胞和C3AR1+巨噬细胞进行 niche 样相互作用，类似于在新生心脏中看到的促再生微环境。这项工作突显了YAP5SA通过由再生性心肌细胞祖细胞和支持性非心肌细胞群组成的特殊细胞 niche 促进心脏再生的关键作用。最近，同一个小组发现了一种通过赖氨酸乙酰化调节YAP活性的翻译后机制。具体来说，赖氨酸265（K265）的乙酰化增强了YAP与细胞骨架成分（如TUBA4A）的关联，导致其胞质滞留并抑制心肌梗死（MI）后的心脏再生。相反，该位点的去乙酰化促进了YAP的核转位，显著增强了再生能力。这些发现强调了翻译后修饰在微调YAP介导的再生中的重要性，并表明调节其亚细胞定位可能代表一种可行的治疗策略。

除了Hippo-YAP轴之外，多种分子调节因子已被证实可驱动心肌细胞增殖。这些包括额外的信号通路、细胞周期调节因子、 microRNAs（miRNAs）、生长因子、转录因子和表观遗传调节因子。总的来说，这些发现支持了这样的概念：心肌细胞增殖是由汇聚信号和效应器的复杂网络 orchestrate 的，而不是由单基因程序 orchestrate 的。多靶点策略在刺激心肌细胞增殖方面显示出强大效果，这一观点得到了越来越多证据的支持。例如，4F显著增强了心肌细胞增殖，并改善了小鼠和猪的心肌梗死（MI）和缺血再灌注（IR）损伤模型的心脏功能。类似地，强制表达OSKM促进了心肌细胞的去分化和增殖，尽管持续激活引发了关于肿瘤发生的担忧。另一个涉及使用Tmsb4x、Tmsb10、Dmd和Ctnna3（2D2P）组合来调节肌动蛋白细胞骨架重塑的策略也被证明可以刺激心肌细胞增殖并支持心肌修复。

尽管有前景，基于基因的多靶点策略引起了重要的担忧，包括不可控的基因表达、免疫激活和致瘤性的风险。相比之下，小分子方法具有若干优势，例如较低的免疫原性、易于递送、剂量可控性和降低的制造成本。研究小组最近发现了一个五种化合物的小分子混合物，5SM，它能强力诱导成年心肌细胞重新进入细胞周期和胞质分裂，从而改善小鼠和大鼠的MI和IR损伤模型的心脏再生和功能。此外，两种FDA批准的氨基糖苷类抗生素，巴龙霉素（Paro）和新霉素（Neo），被证明可以抑制Meis1和Hoxb13，从而促进心肌细胞有丝分裂并恢复损伤后的心脏功能。总之，这些发现强调了基于小分子的多靶点策略用于心脏修复的治疗潜力。然而，它们更广泛的应用面临挑战，如复杂的药代动力学、潜在的脱靶效应以及需要精确的时间安排和药物组合。解决这些局限性对于将这些方法转化为临床可行的疗法至关重要。

心肌细胞再分化的分子和结构调节因子

再分化过程对于在损伤后恢复成熟的心肌细胞身份和收缩功能至关重要。长时间的去分化和增殖可能导致病理结果，如收缩力受损和心脏肥大，这强调了及时有效的再分化的必要性。新兴的研究已经开始解决这一空白。例如，将成年小鼠心肌细胞与新生大鼠心肌细胞共培养表明，新生细胞通过CX43间隙连接传递钙（Ca²⁺）信号，激活钙调神经磷酸酶-NFAT通路，并增强成年心肌细胞的收缩力，突出了细胞间通讯在再分化过程中的重要性。内在的反馈机制也有助于再分化。LATS1/2激酶是Hippo通路的核心组成部分，在去分化过程中被激活，有助于重新建立心肌细胞的成熟度，为了解动态信号转换如何控制再生时间提供了见解。结构重塑同样起着关键作用。心脏二联管是钙处理和兴奋-收缩耦合的特殊部位，必须在再分化过程中重新组装。富含亮氨酸重复序列的蛋白10（LRRC10）是增殖的负调节因子，有助于损伤后二联管的重新形成。其下调促进去分化和增殖，而其重新表达对于功能成熟是必要的。在转录水平上，最近的研究涉及肌肉盲样1（MBNL1），这是一种与成熟心脏基因程序共表达的蛋白质，作为再分化的关键介质。其活性通过Meis1、钙调磷酸酶轴进行调节，将转录控制与钙依赖性信号级联联系起来。

代谢对心脏增殖和再生的调节

心脏代谢转变的跨物种比较

为了更好地理解代谢状态如何影响心脏再生能力，考察不同物种和发育阶段代谢编程的自然多样性是有益的。比较研究揭示了与低等脊椎动物和哺乳动物的再生潜力密切相关的独特底物利用模式。斑马鱼具有显著的心脏再生能力，这主要由适应其长期缺氧水生环境的糖酵解代谢程序支持。蛋白质组学分析表明，成年斑马鱼心室比新生儿小鼠心脏表达了更高水平的脂肪酸氧化（FAO）酶，但低于成年小鼠。然而，在心脏损伤后，边界区的心肌细胞重新诱导糖酵解基因，表明它们优先依赖糖酵解来支持增殖和维持再生能力。这种胚胎样代谢状态的重新激活与其持续的再生能力相一致。

引人注目的是，哺乳动物的胎儿心脏表现出类似的糖酵解表型，这是由子宫内缺氧和胎盘来源的富含葡萄糖和乳酸的底物供应驱动的。然而，出生后几天内，哺乳动物心脏经历了一个快速的代谢转换，其特征是糖酵解抑制和线粒体FAO的强力诱导，最终供应成年心脏中约95%的ATP。这种转变伴随着线粒体的成熟、活性氧（ROS）的增加和DNA损伤反应的激活，最终导致心肌细胞退出细胞周期和再生潜力的丧失。支持这一点的是，对出生后第1天（P1）到P7的小鼠心脏进行的多组学分析揭示了一个从果糖驱动的糖酵解向氧化磷酸化的转变，以及β-氧化酶、酰基肉碱转运蛋白和氧化应激标志物表达的增加。

可比的转变也发生在大型哺乳动物中。新生羔羊的心脏严重依赖葡萄糖和乳酸，FAO可忽略不计。到P4时，脂肪酸可用性增加十倍，启动FAO，同时葡萄糖氧化下降。到几周时，FAO成为主要的能量来源，反映了氧化表型的成熟。类似地，兔心脏在P1时依赖糖酵解和乳酸，但到P14时转换为FAO，这与增殖潜能的停止相吻合。在新生仔猪中，FAO在24小时内启动，并在出生后第二周逐步增加，尽管完全的代谢成熟落后于成年水平。值得注意的是，猪比小鼠表现出更早更快的FAO转换，强调了代谢编程时间上的种间变异性。总的来说，这些跨物种比较突出了代谢可塑性在调节心肌细胞增殖中的核心作用，并表明靶向底物利用可能为重新激活成年哺乳动物心脏的再生提供一条有前途的途径。

促进心肌细胞增殖的代谢调节因子

新兴证据强调代谢重编程是再生过程中心肌细胞增殖的核心驱动力，其功能不仅仅是能量来源，而且是染色质结构和转录网络的动态调节器。关键代谢途径，包括糖酵解、FAO、酮生成、三羧酸（TCA）循环和鞘脂代谢，与表观遗传和转录机制相互作用，以控制心肌细胞重新进入细胞周期。

除了其在能量生产中的典型作用外，代谢 actively orchestrate 定义心肌细胞再生的分子程序。在糖酵解轴内，丙酮酸激酶M2（PKM2）发挥双重作用：催化丙酮酸产生并转位到细胞核，在那里它与β-连环蛋白合作激活增殖性基因程序。并行地，PKM2将中间产物转入磷酸戊糖途径（PPP），为核苷酸合成和氧化还原稳态提供燃料，这对于有丝分裂进程和基因组稳定性至关重要。葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的过表达同样增强了PPP通量，并扩大了具有高增殖潜力的Tnnt2^low心肌细胞群体。

在斑马鱼中，心脏损伤诱导边界区心肌细胞中Pkm和Pdk基因的表达，突显了糖酵解在再生中的保守作用。值得注意的是，丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）3的过表达增强了糖酵解和增殖，而其抑制则损害了再生。

相反，出生后FAO的诱导对增殖构成了代谢障碍。抑制肉碱棕榈酰转移酶1B（CPT1B），这是线粒体脂肪酸摄取的限速酶，会提高细胞内α-酮戊二酸（α-KG）的水平，从而激活赖氨酸（K）特异性去甲基化酶5（KDM5）介导的H3K4me3在成熟基因位点的去甲基化，促进去分化状态。FAO阻断还下调聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1），减少p38 MAPK的激活，并释放对心肌细胞周期的一个关键检查点。PDK4的缺失将代谢重编程为葡萄糖氧化，减弱DNA损伤信号，并在梗死后的新生和成年心肌细胞中恢复增殖。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号进一步说明了代谢控制的塑性。PPARα激活通过FAO促进终末成熟，而PPARδ的遗传或药理学激活则诱导心肌细胞增殖并限制损伤后纤维化。

除了常规燃料，新兴的代谢调节因子如酮体和鞘脂调节心肌细胞命运。β-羟基丁酸酯由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶2（HMGCS2）产生，促进去分化和增殖，尽管其表观遗传机制仍未完全确定。核鞘氨醇-1-磷酸（S1P）由鞘氨醇激酶2（Sphk2）合成，增强了再生基因位点（包括Erbb4、Mef2a和Mef2c）的组蛋白乙酰化，强化了促增殖的转录程序。

在TCA循环中，α-KG不仅作为生物能量中间体，而且作为Jumonji结构域包含蛋白3（JMJD3）的辅因子，促进H3K27me3去甲基化并重新激活细胞周期基因。相反，琥珀酸脱氢酶（SDH）充当代谢制动器。通过丙二酸抑制SDH可抑制ROS产生并缓解增殖的氧化限制。

总之，来自糖酵解、FAO、酮生成、鞘脂代谢和TCA循环的中间产物汇聚到染色质景观上以调节再生能力。因此，靶向控制代谢流代表了一个有前途的治疗途径。未来的工作应侧重于绘制代谢信号的时空动力学，并将其与转录和表观遗传景观整合，以实现对心脏再生的精确调制。

心肌细胞增殖中代谢重编程的递送策略

代谢重编程已成为刺激心肌细胞增殖和促进心脏再生的有前途的策略。这种方法的核心是精确的、上下文依赖的代谢调节剂递送，确保时间控制和细胞类型特异性。各种递送平台的进步已经引入。

小分子提供可逆的、剂量可调的代谢通路调节。例如，二氯乙酸酯（DCA），一种PDK抑制剂，通过管饲法给成年小鼠施用时可增强PDH活性和葡萄糖氧化，从而在心肌损伤后促进心肌细胞增殖。然而，在成年斑马鱼中腹腔注射DCA未能引起类似效果，突显了物种特异性药效学。依托莫司（Etomoxir），一种CPT1B抑制剂，在新生和成年小鼠中腹腔注射，可抑制FAO，导致α-KG积累和组蛋白去甲基化，这两个协同事件驱动心肌细胞去分化和细胞周期重新进入。类似地，皮下注射GW0742，一种PPARδ激动剂，可增强成年小鼠的心肌细胞增殖，而在成年斑马鱼中通过水体暴露递送的PPARδ拮抗剂GSK3787则抑制心肌细胞增殖。相反，抑制糖酵解似乎对再生有害。2-脱氧葡萄糖（2-DG），一种糖酵解抑制剂，腹腔注射，在多种给药方案中持续抑制成年斑马鱼的心肌细胞增殖。Atpenin A5，一种SDH抑制剂，在新生小鼠中腹腔注射，通过减少线粒体ROS产生来增强增殖。

代谢物类似物提供了一种模拟内源性中间产物的靶向方法。腹腔注射二甲基丙二酸可抑制SDH，促进新生和成年小鼠的心肌细胞增殖，而琥珀酸前体二甲基琥珀酸则通过腹腔或静脉途径抑制增殖。补充α-KG同样被证明可以增强新生和成年小鼠心脏的心肌细胞增殖。

基因递送平台能够持续表达代谢调节因子，递送途径影响组织靶向和功效。腺相关病毒血清型9（AAV9）载体已用于通过心肌内或尾静脉注射递送HMGCS2和Sphk2，从而分别增强酮生成和核鞘脂信号，并促进新生和成年小鼠的心肌细胞增殖。然而，病毒载体的长期表达和潜在免疫原性带来了转化挑战。

修饰的mRNA（modRNA）系统提供了一种短暂且可调的替代方案，具有改进的特异性。一个心肌细胞靶向的modRNA平台，包含一个L7Ae-K-基序翻译抑制模块和miRNA识别元件（miR-1和miR-208a），能够在心肌细胞中实现特异性表达。心肌内递送编码PKM2或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的modRNA可增强糖酵解和PPP活性，刺激单核心肌细胞增殖，并在心肌梗死后改善心脏功能。总之，递送的途径和方式是代谢重编程治疗功效的关键决定因素。持续优化空间靶向、时间分辨率和组合策略对于推动代谢干预走向临床转化至关重要。

在猪模型中诱导心肌细胞增殖以改善心脏功能

如上所述，在识别再生生长因子、miRNAs、小分子、细胞周期调节因子和能够刺激心肌细胞增殖的转录因子方面已经取得了显著进展。然而，将这些发现转化为临床疗法仍然具有挑战性。一个关键的瓶颈是来自动物模型的稳健临床前数据的可用性有限，这些数据对于弥合与人类临床应用的转化差距至关重要。小动物模型，包括小鼠和大鼠，在心脏生理学、疾病病理学和免疫反应方面与人类有显著差异，因此限制了它们对人类治疗方法的预测准确性。

因此，最近的努力越来越多地利用猪模型，因为它们的心脏生理和解剖结构与人类更接近，这使得它们在研究心脏修复涉及的再生机制方面特别有价值。使用猪模型的研究已经证明了各种再生剂在心肌梗死（MI）和缺血再灌注（IR）损伤背景下的治疗前景。例如，通过心外膜贴片递送卵泡抑素样1（FSTL1）显著改善了猪IR损伤模型的心脏功能并减少了心肌纤维化。腺相关病毒血清型6（AAV6）介导的miR-199a递送增强了心肌细胞增殖并促进了MI后的功能性心脏恢复，尽管剂量依赖性的毒性和安全性问题仍需解决。类似地，重组人Agrin（rhAgrin）在猪心脏中对IR损伤表现出保护作用。此外，施用4F在猪MI模型中保留了心肌功能并限制了梗死面积。值得注意的是，利用心肌细胞特异性mRNA翻译系统（SMRTs）过表达细胞周期蛋白D2（CCND2）导致梗死后的心肌细胞增殖增强和心肌修复。此外，FDA批准的氨基糖苷类抗生素Paro和Neo，抑制Meis1-Hoxb13相互作用，在促进心肌细胞增殖和心肌再生方面显示出临床前疗效。总之，这些发现表明，最初在小动物模型中识别的再生因子在猪中保持了其促再生功效，为其转化潜力提供了必要的验证。

结论与展望

重新激活成年心脏中的心肌细胞增殖仍然是再生心脏病学的核心目标。尽管越来越多的工作已经确定了促进去分化、代谢重连和细胞周期重新进入的转录和代谢调节因子，但几个挑战继续阻碍临床转化。一个主要障碍是缺乏对暂时重新获得增殖潜力的心肌细胞的明确分子定义。尽管成熟的心肌细胞可以部分去分化，重新进入细胞周期，并随后再分化，但仍然缺乏追踪这些短暂状态的特异性标志物。这限制了我们确定再生性心肌细胞是构成一个独特的祖细胞样群体，还是代表了成熟心肌细胞池中更广泛的、可逆状态的能力。增加这种复杂性的是心肌细胞去分化过程中结构和代谢重塑的紧密耦合。许多因子，包括Hippo-YAP信号、NRG-ErbB信号、HMGCS2、OSKM重编程因子、4F混合物和5SM化合物组合，已被证明通过同时驱动表型去分化和代谢重编程来促进心肌细胞增殖。然而，这些事件之间的因果层次关系仍不清楚。代谢转变是启动去分化还是作为其结果发生仍在研究中。剖析这种关系对于识别调节心肌细胞命运的可操作代谢节点至关重要。对再生干预措施的精确时空控制代表了临床转化的另一个主要障碍。许多促增殖信号广泛表达且剂量敏感，不加区别的激活可能导致心律失常、异位增殖或病理性重塑。一些递送方法仍然难以实现空间精度和剂量灵活性。创新工具，包括组织再生增强子元件（TREEs）和可诱导表达系统（如药物可激发选择性剪接模块，DreAM），为空间限制和时间可逆的基因控制提供了有前途的解决方案。然而，它们在递送代谢调节因子方面的应用仍然 largely 未探索，需要进一步改进以满足心脏再生的需求。最后，将代谢与转录和表观遗传重塑联系起来的下游效应器仍然特征不佳。尽管诸如HMGCS2、SDH和PDK4等因子已被证明可促进心肌细胞增殖，但它们与染色质和基因调控网络的整合尚未明确。未来的研究需要整合代谢流分析、染色质可及性测定、单细胞转录组学和时间分辨的功能扰动，以构建代谢引导的心脏再生的系统级视图。此外，尽管几种心肌细胞增殖调节因子已在猪模型中进行了测试，但这些研究中的代谢分析仍然很少。而且，大多数在啮齿类动物中促进心肌细胞增殖的基于代谢的调节因子尚未在猪中进行功效评估。鉴于物种间的生理和代谢差异，在大型动物和人类相关系统中验证这些靶点对于推进临床转化至关重要。总之，该领域正在从发现转向转化。更深入地理解结构去分化、代谢重连和细胞周期激活如何相互作用，以及如何在临床环境中精确调制它们，将是实现再生受伤人类心脏目标的关键。