HSV-1复制缺陷型载体中UL27基因突变诱导神经元超兴奋性：对基因治疗安全性的警示

本研究针对HSV-1复制缺陷型载体在基因治疗应用中存在的安全隐患，通过全基因组测序、电生理学和病毒工程技术，发现UL27基因（编码糖蛋白gB）的特定突变（特别是A549I）会增强载体融合性，导致转导神经元出现超兴奋表型。该研究为HSV-1载体的质量控制提供了关键依据，对神经系统基因治疗的安全性评估具有重要意义。

　　

随着基因治疗技术的快速发展，疱疹 simplex 病毒 1 型（HSV-1）因其大基因组容量和天然神经元嗜性，成为神经系统疾病基因治疗的有力候选载体。特别是复制缺陷型HSV-1载体，如JANI8骨架，已被证明能高效、安全地介导外源基因在脑实质中的长期表达。然而，野生型HSV-1本身具有神经毒性，既可参与神经退行性过程，又能引起脑炎等严重神经系统疾病。更值得注意的是，某些HSV-1毒株还能通过糖蛋白介导的膜融合作用，导致神经元间形成合胞体，引起电耦合和异常放电，这为HSV-1载体的临床应用埋下了安全隐患。

尽管复制缺陷型载体在制备过程中通常会淘汰那些产生明显合胞体现象的克隆，但研究团队怀疑，某些不产生明显形态学变化但仍具有融合活性的病毒批次可能会被忽视，从而带来潜在风险。为了深入探究这一问题，研究人员开展了一项针对HSV-1复制缺陷型载体安全性的系统研究，相关成果发表在《Gene Therapy》期刊上。

研究团队运用了多项关键技术方法：采用全基因组测序（Illumina NGS技术）对病毒批次进行基因变异检测；利用电生理学技术（全细胞膜片钳技术）在转导的大鼠原代海马神经元上记录膜电位、输入电阻、自发放电频率等指标；通过钙成像技术（Fura-2染料）测量细胞内钙离子浓度；并利用Red重组等病毒工程技术构建了特定的gB基因突变载体（如JANI8_A549I和JANI8_A549T）进行功能验证。实验所使用的原代海马神经元细胞来自新生Sprague-Dawley大鼠。

一些JANI8载体批次可改变神经元生理功能

研究人员发现，虽然表达tdTomato的JANI8-1载体在原代海马神经元中实现了高效转导且未引起明显的细胞毒性或形态变化，但电生理记录却揭示了显著异常：转导神经元的输入电阻（Rin）显著降低，静息膜电位（RMP）更超极化，自发放电频率和瞬时频率（用于衡量爆发式放电活动）均显著升高。此外，动作电位后的超极化（AHP）幅度增大，动作电位形状也发生改变。这些电生理改变与以往在野生型合胞HSV-1毒株感染的感觉神经元中观察到的现象相似，提示某些JANI8批次可能仍具有融合活性。

JANI8载体的单克隆扩增可能导致基因突变

通过全基因组测序，研究人员对比了有电生理异常但无合胞形态的JANI8-1批次和具有明显合胞现象的JANI8-Syn批次。他们在UL27（编码糖蛋白gB）、UL46、US7和US10等多个基因中发现了错义突变。其中，UL27基因的突变尤为引人关注，因为gB是疱疹病毒科最重要的融合蛋白之一。JANI8-Syn批次独有的R858H和S869N突变已知能增强膜融合活性，而JANI8-1批次携带的D285N、A315T和A549I突变（其中D285N是人为引入，A549I是新发现）则被推测是导致其细微但有害的融合表型的原因。

JANI8-1载体诱导的电生理改变与融合事件相关

为了验证融合假说，研究人员进行了染料耦合和电耦合实验。将绿色荧光染料Neurobiotin-488通过膜片钳电极注入一个转导的神经元后，染料扩散到了邻近的tdTomato阳性神经元中。双细胞膜片钳记录进一步证实，成对的转导神经元之间存在稳健的电耦合（耦合系数平均为0.65）。这些结果强有力地表明，JANI8-1病毒载体通过诱导神经元间膜融合，形成了直接的细胞间连接，从而促进了异常电活动的传播。

阻断电压门控钙通道可降低JANI8-1转导神经元的过度活动

钙成像结果显示，JANI8-1转导的神经元其静息态细胞内钙离子（[Ca²⁺]_i）水平显著高于对照组。药理学实验发现，河豚毒素（TTX，电压门控钠通道阻断剂）和NNC-55-0396（T型钙通道阻断剂）能有效降低转导神经元的放电频率，而AMPA受体拮抗剂NBQX则效果不显。这表明异常放电主要源于电耦合介导的同步化活动，而非突触介导的兴奋。

gB基因中的A549I突变足以增强JANI8的融合特性

为了确认UL27基因突变的关键作用，研究人员构建了仅携带特定gB突变（D285N, A315T, A549I 或 D285N, A315T, A549T）的新病毒批次JANI8_A549I和JANI8_A549T。在低感染复数（MOI=1）下，两者均未引起显著电生理改变。但在高病毒载量（MOI=3）下，JANI8_A549I（A549I突变）能部分重现JANI8-1的表型，包括更超极化的RMP、降低的Rin趋势以及增加的放电频率和爆发活动；而JANI8_A549T（A549T突变）则无此效应。这一结果证明，gB NT1突变，特别是A549I点突变，足以赋予病毒载体融合活性并改变神经元生理功能。

讨论与结论

本研究深入探讨了HSV-1复制缺陷型载体在制备过程中因基因组不稳定性而产生的遗传突变及其功能后果。研究发现，UL27基因（gB）的特定错义突变（如A549I）能够显著增强载体的融合能力，导致转导的神经元发生电生理耦合、钙稳态失衡和超兴奋性。这种细微的合胞表型在常规的形态学质检中可能被遗漏，但却对神经系统的基因治疗安全构成了潜在威胁。

该研究的发现具有重要的转化医学意义。首先，它强调了对基于HSV-1的基因治疗载体进行严格质量控制的必要性，高通量测序和功能学检测应成为病毒批次放行的必备环节。其次，研究为开发更安全的载体提供了方向，例如通过工程化改造，在用于病毒生产的互补细胞系中反式提供重要的病毒基因（如UL27），以减轻复制过程中的突变压力。最终，这项工作为确保HSV-1载体在神经系统疾病基因治疗中的安全应用提供了关键的科学依据和实践指导。